可溶性多糖的测定.docVIP

可溶性多糖含量的测定 摘要: 黑豆样品经甲醇回流脱脂, 热水提取、乙醇沉淀, 以葡萄糖为对照品, 用苯酚 - 硫酸比色法测定其中水溶性多糖的含量。葡萄糖浓度在 20.192~100.960 ug/mL 范围内, 与吸光度呈良好的线性关系, 回归方程为: A=﹣0.0012+0.008 88 C( r=0.997 5) , 测得黑豆中水溶性多糖的含量为( 33.74±0.80) % , 精密度为 1.93 % ; 对照试验的回收率为( 99.00±1.57) % , 精密度为 1.48 % 。 关键词: 黑豆; 水溶性多糖; 苯酚 - 硫酸比色法; 含量测定 1 材料、仪器和试剂 1.1 材料 黑豆 1.2 仪器 CS101- 1D 鼓风干燥箱， LXJ- IIB 离心机，722 光栅分光光度计，食物搅拌器 SS250- A ，SHZ- 3 型水循环真空泵，电动搅拌机， BS110S电子天平，SZ- 93自 动 双 重 纯 水 蒸 馏 器 ，FD- 1- 55 冷冻干燥机 1.3 试剂 甲醇, 氯仿, 正丁醇, 浓硫酸, 苯酚, 葡萄糖标准品( 105 ℃干燥至恒重) 等均为国产分析纯试剂。苯酚储备液的制备: 取苯酚 200.0 g, 加锌粉 0.2 g和碳酸氢钠 0.1 g, 蒸馏收集 182.0 ℃分馏, 称取此馏分 80.0 g, 加 20.0 g 水使其溶解, 为 80.0 % 苯酚储备液, 置冰箱中避光贮存备用。6.0 % 苯酚溶液: 临用前以 80.0 % 苯酚配制,置棕色瓶中备用。 2 方法与结果 2.1 样品前处理 用清水将黑豆洗净, 沥干鼓风干燥箱中先于 80 ℃高温灭菌 20 min, 后于 40 ℃干燥至恒重, 用食物搅拌器将其粉碎并过20 目筛, 即得黑豆干粉。 2.2 样品的提取与制备 准确称取黑豆干粉样品 100.0 g, 加 400.0 mL甲醇水浴回流 3 次, 每次 3 h, 离心, 弃去滤液, 滤渣干燥。加 1 000.0 mL 水于 60 ℃水浴提取 3 次, 每次6 h, 离心, 合并上清液, 减压浓缩至 1/3 体积, Sevag法除蛋白, 对去离子水透 72 h, 透析液浓缩至 1/3体积, 加入工业酒精沉淀, 冰箱放置过夜, 离心。沉淀物以水溶解重复醇析 1 次, 再用无水乙醇, 丙酮洗涤, 真空冷冻干燥测黑豆粗多糖含量 2.3 标准曲线的绘制 2.3.1 标准溶液的配制 精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品 0.252 4g, 置于小烧杯中, 加去离子水溶解, 移入 250 mL 容量瓶中, 以去离子水定容至刻度, 摇匀, 配成 1.009 6mg/mL 的标准溶液。然后准确吸取葡萄糖标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 分置于 50.0mL 容量瓶中, 加去离子水定容, 摇匀, 得系列对照品溶液。 2.3.2 标准曲线的绘制 准确吸取上述系列对照品溶液各 2.0 mL, 分置于具塞试管中, 各加入 6.0 %苯酚试剂 1.0 mL, 摇匀,在冰水浴中各加入浓硫酸 5.0 mL, 摇匀, 冷却至室温, 一起浸入沸水浴中加热 10 min, 取出冷却至室温, 于波长 490 nm 处测其吸光度。同时准确吸取去离子水 2.0 mL, 同法操作, 作为空白对照。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)（ 见表 1) 做回归处理( 见图 1) , 得 回归方程: A =- 0.001 2+0.008 88 C, r=0.997 5。 2.4 样品含量测定 精密称取干燥至恒重的黑豆粗多糖 0.052 2 g,置于小烧杯中, 加去离子水溶解, 移入 25.0 mL 容量瓶中, 加去离子水至刻度, 摇匀。准确吸取该溶液2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL 分置于 50.0 mL 容量瓶中, 加去离子水至刻度, 摇匀, 即得样品溶液。准确吸取上述溶液各 2.0 mL, 按 2.3.2 计算, 式中 x 为黑豆粗多糖中水溶性多糖含量;ε= ？, 为多糖的校正系数 ; C1为标准曲线上查得的样品浓度(μg/mL) ; C2为加入的样品浓度(ug/mL) 2.5 稳定性试验 取 2.4 项下的样品溶液 1 份, 准确吸取 2.0 mL,按 2.3.2 方法测定吸光度, 每隔 20 min 测定一次, 连续 2 h 考察其稳定性, RSD=？ 2.6 葡萄糖对照试验的回收率及精密度准确吸取葡萄糖标准溶液各 1.5 mL、2.5 mL、3.5mL、4.5 mL分置于 50.0 mL容量瓶中, 加去离子水稀释至刻度, 摇匀。再准确吸取上述溶液各 2.0 mL, 按2.3.2 方法操作, 测