RACE的几点建议RACE的几点建议.doc

RACE-PCR克隆基因的几点建议 关键词：2007-07-21 ? ??我要评论?? ? 摘　要： RACE是一种快速克隆cDNA末端的方法，目前, 该方法被广泛应用于未知碱基序列基因的克隆，尤其是SMART　RACE技术更为人们所青睐。本文总结了我们实验室用SMART　RACE技术克隆基因的一些心得体会，希望对用RACE方法克隆基因的同行有些帮助。 关键词：　RACE;　RNA提取;　兼并引物　 中图分类号 :Ｑ75　　　文献标识码 :Ａ Some Suggestions on Gene Cloning by RACE-PCR Abstacts：RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) is a method of quickly cloning of cDNA ends, thus, this method was widely noticed by scholars of biology, from now on, its was abroad used in animal and plant gene cloning. However it should be pay attention to following three aspects: firstly, primers design is should be think over; secondly, it is very important of the quantity of RNA; thirdly, the optimization of PCR conditions you should be give more attention to. In this paper, we discussed three important questions in RACE-PCR, we hopes this paper will help those who is going to engaged in cloning new genes by RACE-PCR. Keyword: RACE; RNA extraction; Degenerate primer 　 真核细胞的mRNA在加工过程中其3末端加上一段Poly A，这是利用反转录酶制备cDNA文库的基础，但是由于cDNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，曾经是一个令人困扰的问题。80年代末、90年代初发展起来的一种快速获取cDNA全长的方法，即RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)，目前这个方法被广泛用于克隆各种未报道的基因，该方法基于PCR技术，步骤少，耗时短，且经济节省，只需知道mRNA内部很短的一段序列或一小段cDNA（如EST）即可用此法克隆出未知的序列。目前，RACE已经不局限在克隆cDNA上，在克隆cDNA相邻序列以及基因组片段等方面也得到越来越广泛的应用。RACE技术使传统筛库的方法寻找全长基因的过程从几个月，缩短为几天。尤其对于低丰度基因的克隆优势更为显著[1]。 我们实验室用在合成cDNA的双链后，在两端连上接头引物，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增,分别从水稻和小麦中克隆到了TPT[2,3]。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。此外，由于mRNA容易降解，很难确定得到的cDNA是全长的cDNA，还是cDNA的片断？ RNA反转录5’末端交换机制（Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript，SMART）技术的出现是一个新的里程碑。其原理如下：在合成cDNA的反应中，事先加入的5末端带Oligo（dT）的SMART引物（如5–(T)25N-1N–3，N = A, C, G或T；N-1 = A, G或 C），由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo　dG（5–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链