实验9-核酸的定量测定.pptVIP

实验九 核酸的定量测定 实验目的 1、掌握二苯胺法测定DNA含量的原理以及操作步骤。 2、熟悉紫外法测定DNA含量。 * 核酸定量测定常见的方法 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟基-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应。 DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.8以上。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。  核酸紫外吸收光谱的测定 DNA的 A260/A280 ≈1.9 表示DNA