实验10-质粒DNA的提取1.PPTVIP

实验目的 掌握碱法提取质粒的基本原理； 掌握碱法提取质粒各试剂的组成和作用。 掌握微量移液器的正确使用。  质粒（Plasmid）是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的，共价、闭合、环状双链DNA分子（covalently closed circular DNA）,也称为cccDNA。 大小可为1kb到200kb。 它是细菌内的共生型遗传因子，其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 结构的三大要素 多克隆位点（multiple cloning site, MCS），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的一段很短的DNA序列。 选择标记：耐药性（R质粒），LacZ基因 独立的复制单位：ori （ origin of DNA replication） 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA等 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 在碱性条件（pH 12.5）下，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。 将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DN