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考点一　基因工程的概念及操作工具(5年13考)(2015天津、福建、重庆、浙江、江苏；2014新课标、天津、北京、山东、江苏、海南；2013全国大纲卷、广东……)一、基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平原理基因重组基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物或生物类型供体提供目的基因受体表达目的基因本质目的基因在受体体内的表达优点可定向改造生物的遗传性状二、DNA重组技术的基本工具1．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)2．DNA连接酶常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果都缝合磷酸二酯键，如图3.载体(1)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(2)质粒的特点1．下图为限制酶和DNA连接酶的关系，据图回答：(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？相同。(2)DNA连接酶起作用时是否需要模板？不需要。2．探究载体所具条件的意义条　件意　义稳定并能自我复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择基因工程操作工具的综合考查(经典高考题)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATT C……GG……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是________，产物是_____________________________________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是____________________________________________________________________。1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸DNADNA酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部分解为两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端2.限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。1.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是(　　)A．①②③④　　　　　B．①②④③C．①④②③D．①④③②2.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是(　　)A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3.已知一双链DNA分子，用限制酶Ⅰ切割得到长度为120kb(kb：千碱基对)片段；用限制酶Ⅱ切割得到40kb和80kb两个片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ