实验5 诱导细胞融合——聚乙二醇法课件.pptVIP

一、实验目的 了解细胞融合的原理，初步掌握用PEG诱导细胞融合的方法。 二、实验原理 聚乙二醇（PEG）结构为： CH2(OH)-(CH20CH2)n-CH2OH； 相对分子质量在2000-6000均可用作细胞融合剂。 普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。 细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。 三、实验材料与用品 材料：鸡血红细胞 试剂： （1）Alsver液： （2）0.85％生理盐水： （3）GKN液： （4）Ringer溶液： （5）Hanks液： （6）50％PEG混合液 （7）0.2%次甲基蓝 四、实验步骤 1.鸡血红细胞悬液的制备： 用注射器吸入 1mL Alsver液后从鸡翼下静脉取鸡血2mL，注 入刻度离心管内，按照3：1(V/V)加入6mL Alsver液混匀，放入4℃冰箱内可保存3~4天。 2.取细胞悬液1mL，移人7mL离心管， 加入4mL 0.85％生理盐水混匀；2000r/min离心5 min。 3.弃上清液（用吸管吸去），加0.85％生理 盐水至5mL，混匀后2000r/min离心5min。 4.重复上述条件，再离心洗涤1次。 5.收集最后1次离心沉淀的血细胞，加入 适量的GKN液溶液，按压积红细胞体积配成10％的红细胞悬液。 50％PEG混合液配置：称取少许PEG放人刻度离心管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制。 6.取悬液1mL到7ml离心管中，加入0.5～0.8 mL预热的50％PEG （慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管,使其混匀），38℃水浴中温浴30min。 7.缓慢加入Hanks液5ml以终止PEG的作用，轻轻吹打混匀，38℃水浴中静止5min。 8.1000r/min离心5min，去上清，指弹使细胞团分散 9.取细胞悬液1滴滴于载玻片上，盖上盖玻片直接镜检；或加入台盼蓝溶液1滴，染色3分钟盖上盖玻片，显微镜下观察细胞融合现象。 10.进行多个视野的测定，统计细胞平均融合率。 五、结果与分析 1、绘制观察到的融合细胞图，计算观察到的细胞融合率；　　　 2、简述聚乙二醇法诱导细胞融合的原理及影响融合的关键因素。 六、注意事项 如抗凝血要保存在冰箱，抗凝剂预先要进行灭菌，采血在无菌条件下进行。 PEG有毒，请操作过程中勿沾到皮肤上。 * * 实验五 诱导细胞融合——聚乙二醇法 仪器：离心机，水浴箱，电炉， 量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯， 吸管，载玻片，盖玻片，显微镜 *