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Department of Immunology 实验二 抗体生成细胞检测 免疫学教研室 李宗喜 5346 脾脏 第二大免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液 小鼠B细胞溶血空斑形成试验 溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，是用于检查动物的抗体产生功能的经典的试验。 将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC在琼脂凝胶内混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。 实验原理 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统 活化阶段 试剂与器材 1. 小鼠； 2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）； 3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液 0.5ml，补体0.3ml，Hank’s液2.0ml； 4. 细胞裂解液0.17mol的NH4Cl； 5. Hank’s 液（pH7.2）、凡士林油； 6. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、试管、吸管、载玻片、盖玻片、双面胶； 7. 微量进样器和离心机等。 操作步骤 免疫小鼠 血清分离 脾细胞分离、计数 溶血空斑试验 血清分离 眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用1.5mlEp管接住流出的血液。每次采血量1－2ml。 4℃静置24h，离心10000rpm，5min，收集血清，-80℃保存待抗体水平检测。 脾细胞分离计数 处死小鼠 取脾 制备脾细胞悬液 脾细胞计数 取脾 70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位 左侧肋骨最低点与髋关节间做2.5cm切口 镊子钝性分离结缔组织，暴露腹膜 腹膜做2cm切口，暴露脾脏 分离结缔组织和系膜 脾脏放入5mlHank’s液的平皿中 制备脾细胞悬液 镊子夹住脾 注射器吸取2mlHank’s液 刺入脾脏冲洗脾细胞 收集8ml细胞悬液于离心管 1500rpm离心10min去上清 2ml冷NH4Cl裂解RBC约5min 1500r/min再离心5min去上清 Hank’s液5ml洗涤细胞，2000r/min离心10min去上清 悬浮细胞于1ml的Hank’s液中 脾细胞计数 10倍稀释脾细胞悬液 计数脾细胞 调整细胞浓度至2×l06/ml 使用显微镜 安放好载玻片 打开电源 调整瞳孔间距 调整光源 先粗调，再微调 10×物镜找到细胞层和计数室 40×物镜找到白细胞计数区域 细胞计数板（Hemacytometer） 表面雕刻有带刻度的计数室用来计数细胞和微粒的特制玻璃板。 细胞计数板 计数红细胞 溶血空斑试验 制作反应板 加样：30ul 温箱10分钟 定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS） 该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。 溶血反应试验 ELISA-空斑试验 又称酶联免疫斑点试验ELISPOT。该法与ELISA不同之处是，加入的待检标本是细胞，而非可溶性物质；所使用的底物可形成不溶性终产物。 ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细胞和巨噬细胞。 结束 * * 识别阶段 膜攻击阶段 细胞浓度/ml=稀释倍数×4个方格的平均数×104 计数方法 细胞浓度/ml=稀释倍数×5个小方格总数×5×104 双面胶 盖玻片 0.2ml - 0.2ml C 0.6ml 0.6ml 0.4ml N.S. 0.2ml 0.2ml 0.2ml sRBC - 0.2ml 0.2ml 溶血素 3 2 1 * *