生物化学-质粒DNA测定实验报告..doc

实验名称 (Title of Experimetn) 质粒提取、定量与酶切鉴定(Date of Experiment) 2015-11-17 实验地点(Lab No.) 第四实验室 合作者(Partner) 指导老师(Instructor) 总分 (Total Score) XX 教师签名(Signature) 李某某 批改日期 (Date) 2013-06-03 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 1．实验原理 质粒DNA定量测定-紫外光吸收法 A260/A280的比值可以反应DNA的纯度 Ratio= 1.8 DNA样品较纯,符合实验要求； Ratio＞1.9 RNA污染； Ratio＜1.6 蛋白质或其它杂质的污染； 4）质粒DNA的酶切鉴定 限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶,可分为型。其中，II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列，其识别位点长度为4～6个核苷酸的回文序列。本实验中用到的两种酶类：EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶，可将质粒DNA割成不用大小片段。不同质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位点和数量也不同。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 迁移速率DNA＞DNA＞开环的双链环状DNA 2.实验材料 样品 2）试剂： 质粒提取试剂盒：溶液S1（细菌悬浮液）、裂解液S2、中和液S3、洗涤液W、洗脱液、RNase A(100mg/ml)、DNA吸附柱 Hind III核酸内切酶（TaKaRa） 电泳实验上样缓冲液 EcoR I核酸内切酶（TaKaRa） 10× M 酶切缓冲液： 蒸馏水 3）仪器： 1）碱裂解法提取质粒 2）质粒DNA定量测定 3）质粒DNA的酶切鉴定 在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 体积（μl) 10× M 酶切缓冲液 2 质粒DNA 500~1000ng (10 μl) Hind III 1 EcoR I 1 H2O 至 20 混合后37 ℃水浴1～2h 琼脂糖凝胶电泳：制备 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀。用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6 μl 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电泳条件：电压80v；时间25～30分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带。取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。 4.注意事项 1）碱裂解法提取质粒DNA 加入250μL裂解液S2不可过分用力振荡，避免染色体DNA因外力作用断裂成小片段，从而与质粒DNA混合在一起，引入误差。 2）紫外分光度法测定酶切质粒DNA （1）拿UVette比色皿时，应注意拿着比色皿的粗糙面。最好在使用之前用干净的纸巾擦拭光学面。并且放比色皿时注意将光学面与出光方向一致。空白对照和样品应该在同一个比色皿中检测，以防误差。 （2）在比色皿中稀释时，要用加样枪充分混匀并防止气泡和其他悬浮物的出现。 （3）在酶切反应体系中，质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起的试剂的污染，而且在混合后避免强烈振荡，保证不使内切酶变性及DNA分子的完整。 3）质粒DNA的酶切分析 （1）因为缓冲液具有致癌性，所以在混合缓冲液是一定到戴手套操作。若不慎沾到要立即用大量清水冲洗。 （2）离心管中混匀物质时，HindIIIEcoRI应最后加入。3）水浴时应把管盖盖紧，避免水蒸气进入。 【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：XX】 1.实验条件 1）材料：实验室提供 2试剂：规格用量严格按照操作步骤中要