第三节2多肽和蛋白质类药物的生产（参考）.pptVIP

3.4．菌体收集 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。 4 干扰素的分离纯化工艺过程 4.1、干扰素分离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程 4.1 干扰素α-2b分离工艺过程 菌体裂解 预处理 初级分离 (1)菌体裂解 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟） 。 破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。 (2)预处理-沉淀 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。 (3)离心 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。 （4）初级分离 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。 4.2、干扰素纯化工艺过程 溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装 (1) 溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解： 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。 (2) 沉淀与疏水层析 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。 (3)阴离子交换层析与浓缩 0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱， 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。 （4)阳离子交换层析与浓缩 用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。 (5)凝胶过滤层析 洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分 (6)无菌过滤分装 0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 分装 －20℃以下的冰箱中保存。 (7)检测项目 干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素 发酵法生产白细胞介素 白细胞介素的结构与功能 Interleukin，简称IL。 目前批准上市的有IL-2、IL-6、IL-12等。 IL-2分子量为１４５００的糖蛋白，它刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的Ｔ细胞增殖。重组白介素－２可用于临床研究。主要用于肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤有效（Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ）。ＬＡＫ细胞代表１个有单核巨噬细胞，Ｂ和Ｔ淋巴细胞特征的异原的细胞体。这些ＬＡＫ细胞似乎对癌细胞有特异作用。此外，ＬＡＫ细胞（不象Ｔ细胞）介导杀伤不受ＭＨＣ的约束。 生产工艺1 工艺流程图 IL-2工程菌 斜面 摇瓶 发酵 制备包涵体 洗涤与裂解 凝胶过滤与复性 检定与包装 2 生产过程及工艺过程 (1)发酵 工程菌为大肠杆菌，温度敏感型。 种子用LB培养基； 发酵用M9CA培养基，30度10小时，后提高温度至42度，诱导3h。 (2) 分离纯化 包涵体制备 离心收集，菌体悬于EDTA溶液中，用超声波破碎细胞，后8000r/min离心，收集沉淀(包涵体和细胞碎片)。 包涵体洗涤及裂解： 用Tris-HCl洗涤3次，离心收集沉淀，用盐酸胍变性，离心收集上清液。 凝胶过滤及复性： 上清过Sephacryl