AIDS实验室检测0807__培训课件.pptVIP

* * * 细胞亚群的细胞获取数 Beads 总量 细胞亚群的 X = Beads获取数 样本量 (μl) 绝对数（细胞数/μ l） CD45 PerCP SSC 流式细胞仪T细胞亚群绝对计数原理 MMWR, 2003: 52(RR02);1-13 * RT-PCR bDNA NASBA LCx HIV RNA检测的方法 RT-PCR、NASBA检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染，而使RNA降解 bDNA与RT-PCR、NASBA相比较有较好的稳定性、线性和可重复性 特殊人群：怀疑急性期感染者，母婴传播，核酸检测能够提供早于免疫学指标的诊断，已经被认为是18个月以下婴幼儿诊断的金标准。 除早期诊断外，HIV RNA测定能够监测HIV慢性感染者病情的发展。 以及作为评价HAART治疗效果的评价指标。 应用核酸杂交法或应用PCR法检测HIV的前病毒DNA可确定细胞中HIV潜伏感染情况。 由于其固有的高敏感性，某些国家已经采用这种技术用于献血员的筛查，被认为与经典免疫学筛查方法相比，可以降低输血传播约50%。 * NASBA 技术 NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 早期产品为NASBA HIV-1 RNA QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。 NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶，以在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。 Triton X-100裂解病毒提取核酸 加入铷标记的内标 电化学发光检测 根据内标计算野生株拷贝数 * RT-PCR 技术 基本原理是通过逆转录酶的作用将样品中RNA逆转录合成DNA后进行聚合酶链式反应（RT-PCR），方法较为简单 异硫氰胍裂解液裂解病毒，释放出核酸成分。 加入一个已知拷贝数量的合成RNA分子作为定量标准（QS），然后进行RNA提取。 使用引物在逆转录酶的作用下逆转录产生142碱基的gag基因片段（DNA），通过PCR方法对此基因片段进行扩增。 清洗掉未杂交的反应产物后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，亲和素与扩增产物上的生物素结合 HRP的底物进行显色反应，测定OD值。 * bDNA 技术 bDNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即bDNA信号放大系统，这是一个人工合成的bDNA，bDNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应 首先将血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，HIV RNA释放后加入微孔板中 板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针，靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与bDNA结合，加入酶标记物对结合的bDNA进行标记 经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度 本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。 * HIV RNA 应该在感染后从血清转换至AIDS 全程可以检测地到。但实际感染者中许多血清HIV RNA 水平并不高，有些患者在无症状阶段甚至低于400 拷贝/毫升。 对于一些敏感性不高的试剂盒，该阶段可能会出现HIV RNA 检测阴性的结果。 其它一些因素也会影响检验结果的准确性 地理因素感染亚型和循环中病毒重组的影响 病毒变异导致扩增引物特异性变化 病毒准种复杂性 HIV RNA检测结果解读注意事项 * 近期HIV感染患者的识别:STARSH分析 新近感染的识别有助于HIV传播模式的评价 新近HIV血清学转换测试算法（STARSH）是一系列分析方法 这些分析方法主要是基于HIV感染后一系列典型的免疫学事件 这些分析方法一旦在HIV特异性抗体生成，并不能鉴别哪些患者是慢性感染者，哪些是新近感染者 总体评价 * 近期HIV感染患者的识别:STARSH分析 常用方法 “失调”分析（detuned assay） 该技术基于HIV感染早期阶段诱导机体所产生的抗体亲和力和滴度都比较低，而随着疾