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【2017年整理】TALEN基因编辑技术
前言
转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术与锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具,这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂(DNA double-strand break)来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复,TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。
成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR)技术是最新出现的一种基因组编辑工具,它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与其它基因组编辑工具相比,CRISPR技术更易于操作,具有更强的可扩展性。
本文将以上述三种技术为例,介绍并探讨新一代位点特异性基因组工程技术的生物学原理、未来发展趋势,及其在遗传学研究领域的作用和潜在的医学应用前景。
一、TALEN技术
TAL效应因子(TAL effector, TALE)最初是在一种名为黄单胞菌(Xanthomonas sp.)的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE通过细菌 III类分泌系统(bacterial type III secretion system)被注入植物细胞中,通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录,来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力,研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来,形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具,即TALEN。
近年来, TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造,以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。2011年《自然·方法》(Nature Methods)将其列为年度技术,而2012年的《科学》(Science)则将TALEN技术列入了年度十大科技突破,针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。
1. TALEN结构及技术原理
1.1 TALEN的典型结构
如前文所述,典型的 TALEN由一个包含核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)的N端结构域、一个包含可识别特定 DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域,以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。不同类型的TALEN元件识别的特异性DNA 序列长度有很大区别。一般来说,天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17-18bp;而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度 则一般为14-20bp。
图1 TALEN的结构。(A)与靶点DNA(灰色显示,PDB ID:3UGM)结合的TALE蛋白。每一个独立的TALE重复序列元件包含33到35个氨基酸残基,这些TALE重复序列元件能够通过两个高变异度的残 基(即重复可变双残基,RVD,棍状显示)来识别一个单一的碱基对。(B)TALE核酸酶(TALEN)形成二聚体结合DNA的动画演示。TALEN目标 位点由两个TALE结合位点组成,这两个位点间通过不同长度的间隔区序列(12-20bp)分开。 TALE可以被设计成仅仅识别左半侧位点或右半侧位点。图片来源: Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405.
1.2 TALEN技术的原理与步骤
TALEN技术的原理并不复杂,即通过 DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合,然后在FokI核酸酶的作用 下完成特定位点的剪切,并借助于细胞内固有 的同源定向修复(HDR)或非同源末端连接 途径(NHEJ)修复过程完成特定序列的插入 (或倒置)、删失及基因融合(图2)。
图2 TALEN进行基因组编辑的原理。利用位点特异性核酸酶可以进行基因组编辑,而核酸酶诱导的DNA双链断裂(DSB)可由同源定向修复(HDR)或非同源 末端连接途径(NHEJ)来修复。(A)在供体质粒(donor plasmid)暴露出延长的同源臂(homology arm)的情况下,HDR可能导致插入的单个或多个转基因发生改变或取代原有的基因
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