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小鼠胚胎成纤维细胞培养及饲养层制备 第一部分 MEF原代分离培养 1.处死小鼠 1.1.取妊娠13.5天的ICR雌鼠，腹腔内注射 0.5ml 三溴乙醇麻醉。 1.2.待小鼠麻醉后分离子宫。 2.解剖孕小鼠并取出胚胎 2.1.在超净工作台内，将小鼠仰卧于吸水纸巾或无菌的塑料膜上。 2.2.用碘酊和酒精消毒小鼠腹部。 2.3.用无菌组织剪剪开皮肤. 2.4.换眼科剪剪开肌层，暴露腹腔。 2.5.眼科镊向上提起子宫角，剪去结缔组织，剪下子宫。 2.6.取出子宫置于一次性无菌培养皿中。 2.7.用10 ml PBS漂洗3次后置于另一洁净培养皿。 2.8.用眼科剪将胚胎包膜剪开，取出胚胎。 2.9.将胚胎转移到一个盛有10ml PBS的洁净培养皿，用PBS漂洗3次。 2.10.计数并记录鼠胚胎数量。 2.11.从胚胎中分离内脏（注意：内脏组织 颜色较深），去除头部。 2.12.将胚胎置于一洁净培养皿，弃去内脏。 2.13.用PBS漂洗3次。 3.剪碎胚胎组织 3.1.吸去多余的PBS。 3.2.用眼科剪将组织剪成米粒大小。 Note：剪切大约5-10分钟，一只手将培养皿扶起，使胚胎组织滑向培养皿一端）。 3.3.加2ml胰蛋白酶(0.1%)，继续剪切2分钟，直至组织块更小。 3.4.再加约30ml 胰酶(每个胚胎约3ml 胰酶)，将培养皿置于37℃,CO2培养箱中孵育15分钟。期间每隔4分钟，取出培养皿用巴氏吸管吹打1分钟 。 4.从培养箱中取出鼠胚组织并分配接种到T75培养瓶内 4.1.从CO2培养箱中取出消化后的组织。 4.2.用10ml 吸管用力吹打消化后的鼠胚组织，直到半流质状。 4.3.加30ml MEF培养基，混匀后将含有组织的培养液移入两个 50ml离心管。 4.4.用少许MEF培养基冲洗培养皿中剩下的组织，再将冲洗液加入到上述50ml离心管中。 4.5.200g×5分钟，离心。用约50ml MEF 培养基重悬细胞沉淀。 4.6.所取出的胚胎数（步骤2.10中记录），就是所需T175培养瓶的个数，即每个培养瓶装1个胚胎组织。 4.7.每个T175培养瓶加25ml MEF原代培养基。 4.8.每个T175培养瓶加5ml 细胞悬液，吹吸混匀。 4.9.将盛有细胞悬液的培养瓶置于37℃,CO2培养箱过夜培养。 5.观察成纤维细胞的培养和换液 5.1.第二天取出培养瓶，镜下观察细胞生长状况。 5.2.吸去上清，换取新鲜MEF培养基。 5.3.继续培养至细胞生长融合90%。 6. MEF的收集和冻存 6.1.PBS漂洗细胞。 6.2.加入适量胰蛋白酶(能铺满瓶壁为宜)，孵育3-5分钟。 6.3.用手掌拍打或敲击瓶壁,直至细胞层完全脱落。 6.4.加入5ml MEF培养基混匀以中和胰蛋白酶。 6.5.用吸管轻轻将细胞团块吹散。 6. MEF的收集和冻存 6.6.收集所有细胞悬液至一50ml离心管， 6.7.让组织块自然沉降，吸取上层细胞悬液至另一50ml离心管。 6.8.200g×5分钟，离心。 6.9.用新鲜MEF培养基重悬细胞。 所需MEF培养基的数量=T175培养瓶的个数×3/2 6. MEF的收集和冻存 6.10.加等量的冻存液(2 ×)混合均匀。 6.11.每支1.5ml 冻存管中加入1ml细胞悬液，拧 紧盖子，置于异丙醇程序降温盒中。 6.12.迅速将程序降温盒放入-80℃冰箱，过夜。 6.13.将冻存管转至液氮罐。 第二部分 MEF传代培养与饲养层制备 1.解冻MEF 1.1.从液氮罐中取出一支MEF。 1.2.用手来回搓冻存管10-15秒。 1.3.将冻存管置于37℃水浴锅水浴，轻轻晃动，注意：不要让水淹过瓶盖。 1.4.当只有小块冰团存在时停止水浴。 1.5.用95%乙醇擦拭冻存管，晾干。 1.6.吸出细胞。 1.解冻MEF 1.7.缓慢加入5ml MEF培养基，轻轻混匀。 1.8.200g×5分钟离心，去掉冻存液。 1.9.弃掉上清。 1.10.加入25ml MEF培养基重悬细胞。 1.11.将细胞悬液转移至T175培养瓶(未经明胶包被)。 1.12.置于培养箱中培养，每天观察细胞密度。 2. MEF传代 2.1.吸去上清。 2.2.加10ml PBS漂洗，弃去PBS。 2.3.加入3ml胰蛋白酶消化3-5分钟。 2.4.拧紧瓶盖，用手掌轻轻拍打或敲击瓶壁，直至细胞从瓶壁脱落。 2. MEF传代 2.5.加入5ml MEF培养基终止消化。 2.6.混匀细胞悬液，将所有细胞收集到一个培养瓶。 2.7.加入30ml MEF培养基使终体积为40ml，混匀。 2.8.每个培养瓶分加10ml细胞悬液。 3.消化细胞行细胞计数 3.1.