人源溶菌酶基因lyzl4在毕赤酵母中的重组表达及活性测定.docxVIP

中 国 生 物 工 程 杂 志 　 Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１４， ３４（ １） ： ７９８５ＤＯＩ： １０． １３５２３ ／ ｊ． ｃｂ． 源 溶 菌 酶 基 因 ＬＹＺＬ４ 在 毕 赤 酵 母 中 的重 组 表 达 及 活 性 测 定 李 新 新 　 陶 建 军 　 余 　 龙 （ 复 旦 大 学 遗 传 工 程 国 家 重 点 实 验 室 遗 传 学 研 究 所 　 上 海 　 ２００４３３）摘 要 　 ＬＹＺＬ４ 是 本 实 验 室 克 隆 的 一 种 ｃ 型 人 溶 菌 酶 基 因 ， 根 据 毕 赤 酵 母 密 码 子 偏 爱 性 对 ＬＹＺＬ４ 基因 进 行 优 化 设 计 ， 优 化 后 的 基 因 克 隆 至 具 有 乙 醇 氧 化 酶 启 动 子 （ ＡＯＸ１） 的 ｐＰＩＣ９Ｋ 载 体 中 。 通 过电 转 化 方 法 整 合 到 甲 醇 营 养 型 毕 赤 酵 母 表 达 菌 株 ＧＳ１１５ 基 因 组 上 ， 再 利 用 不 同 浓 度 梯 度 的 Ｇ４１８ 抗 性 ＹＰＤ 固 体 培 养 基 筛 选 高 拷 贝 转 化 子 ， 经 摇 瓶 发 酵 后 ， 其 上 清 液 在 ＳＤＳＰＡＧＥ 胶 上 １４． ４ ｋＤａ处 出 现 明 显 的 蛋 白 条 带 ， 该 蛋 白 条 带 经 质 谱 鉴 定 证 实 是 人 ＬＹＺＬ４ 蛋 白 。 以 人 溶 菌 酶 （ １６４ ０７１Ｕ／ｍｇ） 作 为 标 准 品 ， 使 用 艳 红 微 球 菌 作 为 底 物 ， 通 过 比 色 法 测 定 重 组 ＬＹＺＬ４ 溶 菌 酶 蛋 白 的 活 性 ， 结 果 显 示 重 组 人 溶 菌 酶 ＬＹＺＬ４ 蛋 白 具 有 明 显 的 溶 菌 活 性 ， 其 酶 活 力 可 达 ３８８９３Ｕ／ ｍｌ。关 键 词 　 重 组 人 溶 菌 酶 ＬＹＺＬ４　 毕 赤 酵 母 　 溶 菌 活 性中 图 分 类 号 　 Ｑ７８　 　近 年 来 抗 生 素 耐 药 性 成 为 困 扰 科 学 界 的 重 大 难题 ， 如 今 使 用 的 抗 生 素 药 物 多 为 几 十 年 前 抗 生 素 物 质［ ９］ ， 这 表 明 ＬＹＺＬ４能 溶 菌 酶 在 男 性 生 殖 中 有 着 重 要 的生 理 学 意 义 。 关 于 重 组 表 达 人 源 ＬＹＺＬ４溶 菌 酶 的 报 道的 衍 生 物 ， 由 于 微 生 物 病 毒 等 所 具 有 的 突 变 性 高 、 适 应能 力 强 等 特 点 ， 导 致 抗 生 素 始 终 无 法 克 服 耐 药 性 这 一问 题 。 而 人 溶 菌 酶 是 一 类 杀 菌 机 制 完 全 不 同 于 抗 生 素的 溶 菌 蛋 白 ， 其 抗 菌 机 制 是 水 解 肽 聚 糖 中 Ｎ乙 酰 胞 壁酸 和 Ｎ乙 酰 葡 萄 糖 胺 中 的 βｌ， ４糖 苷 键［ １］ ， 在 渗 透 压很 少 ， 且 选 择 大 肠 杆 菌 作 为 宿 主 菌 ， 通 过 原 核 系 统 进 行［ １０重 组 表 达 ， 蛋 白 表 达 量 低 ， 活 性 现 象 不 明 显 ］ 。 本 文 利用 真 核 表 达 系 统 毕 赤 酵 母 重 组 表 达 ＬＹＺＬ４蛋 白 ， 毕 赤酵 母 表 达 系 统 具 有 高 效 表 达 、 准 确 加 工 、 转 化 子 遗 传 稳定 的 特 点 ， 可 以 在 非 选 择 压 力 下 实 现 稳 定 传 代 ， 与 原 核作 用 下 导 致 细 菌 细 胞 壁 破 裂 而 发 生 溶 菌 作 用 。 人 溶 菌表 达 系 统 大 肠 杆 菌 相 比 ， 该 体 系 可 直 接 表 达 具 有 生 物［ ２］ ，酶 在 人 体 天 然 免 疫 系 统 中 是 一 种 重 要 的 防 御 物 质广 泛 分 布 于 人 体 各 个 组 织 和 体 液 中 ， 如 ： 肝 、 关 节 软 骨 、血 液 、 唾 液 、 眼 泪 等 。 研 究 发 现 人 溶 菌 酶 有 多 种 生 物 活性 ， 如 抗 菌 防 御 、 趋 药 性 、 防 止 ＨＩＶ病 毒 感 染 以 及 抗 肿［ ３７瘤 等 作 用 ］ 。　 　 人 源 ＬＹＺＬ４溶 菌 酶 是 一 种 在 人 体 附 睾 中 特 异 表 达的 免 疫 活 性 蛋 白 ， 原 位 杂 交 方 法 显 示 仅 在 人 体 附 睾 上皮 细 胞 中 检 测 到 了 其 ｍＲＮＡ分 布 ， 并 且 集 中 于 附 睾 头［ ８部 ］ ， 人 体 附 睾 具 有 成 熟 、 储 存 和 保 护 精 子 的 生 理 功 收 稿 日 期 ： ２０１３１１２９　 　 修 回