精选课件RNA提取结果分析.ppt

RNA提取结果分析 2006.04.28 100mg小鼠肝脏组织 ，液氮中研磨 ，组织碎末立即倒入3ml裂解液内 。加入苯酚后离心，分三管收集上层水相， TE稀释40倍测OD。 共收集1.5ml。 异丙醇沉淀后，可以看见大量白色沉淀，三管合并，600ul裂解液溶解沉淀，TE稀释160倍测OD。 此步共收集600ul。 异丙醇再次沉淀，75％乙醇洗涤两次， 尽量洗干液体，超净台干燥5min，加入100ulDEPC水溶解RNA。TE稀释40倍测OD。 RNA浓度为：1.23ug/ul，共有100ul，总产量为123ug。 100mg组织RNA的含量为400－700ug。 5ul裂解液对OD260有非常大的影响，RNA溶于水会导致OD260/280降低。 产率不高的原因： 1.研磨组织时有损失。 2.两次异丙醇沉淀会有大量损失。 3.乙醇洗涤时为避免长时间干燥，吸的很干。 没有计算出回收率，改进办法： 实验过程中测OD做控制时，使用5ul裂解液＋195ulTE调零。 1％琼脂糖凝胶，旧的缓冲液。 10ulRNA+5ulRNA酶，37℃孵育1h，加入等体积氯仿，振荡后离心取上层水相直接电泳。 1.道：5ul 1号管＋15ulDEP水。 2.道：5ul 1号管＋15ulDEP水，70℃孵育1h。 3道：5ul 1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。 4道：5ul 1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。 5.道：5ul 4号管＋15ulDEP水。 6道：5ul 1号管＋20ulDEP水，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电泳。 7道：5ul 1号管＋15ulDEP水＋5ulRNA酶，37℃孵育1h。加入25ul氯仿，漩涡振荡10s，1000g离心3min，吸取上层水相电。 电泳结果说明： 1.RNA酶有作用，代表提出的是RNA。 2. 37℃孵育，氯仿抽提，振荡对电泳结果没有影响，但RNA有损失 。RNA的消失是酶作用的，而与操作无关。 3.第2道目的在于确认RNA溶液是否有残留的RNA酶。结果说明70℃孵育对结果有影响，RNA有降解。 酶解后进行电泳证明确实提出了RNA，但是电泳条代还是不正常，RNA分子量偏小（在溴酚蓝附近） 。 两种可能，RNA在提取过程中断裂和出现降解。 Trizol试剂提取RNA，2.5×106个细胞，异丙醇沉淀后看到了明显的白色沉淀，30ulDEPC水溶解后，取5ulTE稀释30倍测OD。 RNA浓度为0.522ug/ul，共得到15.7ugRNA。 5ul提取的RNA，1％琼脂糖凝胶，新电泳缓冲液。 与前几次的电泳结果一样，还是看不到28S、18S两条带。 1.换了一种裂解液，但电泳结果还是很像，说明问题不出在裂解这一步。 2.提取时间大大缩短，但电泳结果还是很像，说明长提取时间对结果没有影响。 3. 分析用到的有机溶剂，异丙醇和氯仿是在有裂解液的体系里沉淀RNA的，即使有RNA酶污染也不会降解RNA，异丙醇和氯仿污染可以被排除。剩下的就是乙醇了，两种方法里，加入乙醇操作的时间是相同的，如果乙醇有RNA酶污染，两种方法提取时RNA被裂解的效率是相同的，可以合理解释两次的电泳结果很类似。 4. 70℃保温实验的结果显示，RNA溶液中残留的RNA酶能把稍高分子量的RNA降解，以至于条代集中在胶的下部。产生这几次异常的电泳结果。 5.还有就是电泳的问题。对电泳我一直都没有想出什么办法做控制，也一直没有按照标准的RNA变性电泳来做，。 下次实验的改进： 1.对电泳做改进，电泳的loading buffer，胶，电极槽液都使用DEPC水配制。 2.提取过程中除了测OD做控制外，每一步都留取样品做电泳，确定在哪一步出现降解。这样可能会有盐和蛋白的污染，蛋白污染可以通过氯仿抽提除去，盐对电泳结果应该影响不大，且可以保护RNA不被降解。 * * *