第3章细胞生物学研究方法-2016全解.ppt

* 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) * 9. The technique for the take apart and gather up of cell, and microscope manipulation Preparation and reform of karyoplast and cytoplast Transgenic animals and plants Transgenic mice 10 weeks 44g and 29g 3 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 比如要检测的蛋白为A，它有a, b, c, d 四个表位(epitope)，可以被抗体特异性认识。制作针对A的抗体是将蛋白A的一段，比如包含b+c段，打入兔子（最常见）或其他动物（山羊goat，大鼠rat，鸡chicken，仓鼠hamster），由于这是外来入侵物，动物自身的免疫系统会生产针对它的抗体来清除这个异物，而产生的抗体有些会识别b位点，有些则识别c位点。之所不用完整的蛋白，是因为全长通常会太大。然后收集被免疫了的动物的血清，这个含有针对蛋白A的的多克隆抗体（因为是识别c+d的混合抗体）就称为抗血清（antiserum)。有的产品卖的直接就是抗血清，有的则再一步将抗体纯化出来。这种多克隆抗体一般会便宜一些。 而通过体外刺激小鼠的B淋巴细胞和肿瘤细胞的杂交瘤细胞，分别单克隆进行培养，可以产生出只针对一个表位b的单克隆抗体（monoclonal antibody），这种抗体的特异性更高，但价格也更贵。 抗体Y字形下面的主干部分称为恒定区(Fc)，所有人的抗体的Fc都是一样的 ，所有鼠的抗体Fc也都是一样，所有山头的Fc也都是一样 。 制作只含有兔子一抗 Fc段的片段，再打到山羊中，从而获得了针对兔Fc的抗体。 因为兔子不会对兔子的Fc产生免疫反应，不然就会产生自身免疫疾病，自己产生抗体攻击自己。所以可以是山羊抗兔的二抗。 制二抗，就是用一抗的Fc区去免疫动物，方法同制作一抗。 一抗是一对一（Fab对表位），二抗是一对多（动物二Fab对动物一Fc）。 Fab段的可变区，正是这个区域特异性地识别抗原的表位。就像一把钥匙配一把锁一样，表位b只被含有b‘可变区的抗体识别。 二抗是抗一抗的恒定区。所以相对广谱。 * * * * * * * 2) 密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； PH中性或易调为中性； 浓度大时渗透压不大； 对细胞无毒。 速度沉降离心 特点： 常用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度的介质，将待分离的样品加在离心管的最上层。在离心过程中，体积、密度不同的颗粒就会以不同的沉降带分开，最后收集各区带。 用途：分离体积大小稍微不同、密度相近的颗粒。 * 特点： 在密度连续梯度的介质中，将细胞匀浆置于介质的顶部，离心使匀浆中的不同组分沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡。各沉降带可分别收集。 用途：分离密度不同的颗粒 常用介质：蔗糖(5%~20%) 、CsCI 等密度离心（density-gradient equilibrium centrifugation） * 速度沉降离心 等密度离心 样品 蔗糖的稳定梯度 慢速沉降成分 快速沉降成分 样品 蔗糖的不连续梯度 低浮力密度成分 高浮力密度成分 * 优点：可以对细胞内的各种细胞器的化学组成进行直接的定量分析。 缺点： 1.分离细胞器时难免混入少量其他的细胞器。 2.某种细胞器的表面可能吸附了其他细胞器中某种化学物质。 * 2.细胞内大分子成分的显示方法 通过一些显色剂与某些特殊基团特异性结合的性质，利用细胞化学反应来显示细胞内某组分的分布及强弱的技术。 核酸、糖类、脂类、蛋白质 * Feulgen染色的洋葱根尖细胞 Feulgen染色: 鉴定DNA 紫红色 * 甲基绿-派洛宁染色蛙红血细胞 甲基绿-派洛宁染色：DNA显示绿色与RNA显示红色。 * PAS染色 （过碘酸雪夫染色） 细胞含糖原区呈紫红色 PAS染色法（Periodic?Acid-Schiff stain） ： 过碘酸雪夫染色鉴定多糖呈现紫红色 * 细胞内脂类显示橘黄色 苏丹III（三号苏丹红） ：脂类显示橘黄色 * 考马斯亮蓝染色显示细