提取唾液酸.docVIP

离子交换法提取发酵液中唾液酸 摘要：研究了离子交换树脂从发酵液中提取唾液酸的方法，包括树脂的筛选、吸附条件和洗脱条件的确定，唾液酸纯度达到97. 4％。 关键词：唾液酸；离子交换；吸附；洗脱 中图分类号：Q 503 文献标识码：A 唾液酸(Sialic acids)是一族神经氨酸(Neuraminic acid)的衍生物．广泛存在于动物细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链末端．唾液酸及其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症、肿瘤等方面有很重要的应用价值．有报导从鸡蛋、乳清和酪蛋白中制取的，Roland Sehauer、冯万祥等从猪血中提取唾液酸，WhitehouseIs、钱世均等报导了从大肠杆菌菌种制备唾液酸的方法．作者研究了从大肠杆菌发酵液中提取唾液酸的方法． 1 材料与方法 1．1 实验材料与设备 争光D 314、TD 113树脂由杭州争光化工厂提供，南开D 290、732、717、D 392、D 301一R树脂由南开大学化工厂提供．东大D113、717、D 301×7由山东东大公司提供．中医717、732树脂由中国医药上海试剂公司提供；唾液酸标准品，Planstiehi Lab Inc公司赠送．其余试剂为市售国产分析纯试剂． 1．2 实验方法 1．2 .1 唾液酸的测定方法 唾液酸用间苯二酚法测定． 1．2．2 唾液酸溶液的制备 上柱的唾液酸溶液的制备方法见图1． 1．2．3 树脂对唾液酸的静态吸附 取一定质量浓度、一定体积的唾液酸溶液加入5 mL的湿树脂．在室温下振荡12 h，测定溶液中唾液酸的质量浓度，按下式计算各种树脂的静态吸附量 其中C0 C分别为吸附前后唾液酸的质量浓度 (mg／mL)， V溶液为溶液体积(mL)， V树脂是树脂体积(mL)，W 是吸附量(mg／mL) 1．2. 4 阳离子树脂对唾液酸的动态吸附 一定体积的阳离子树脂装到柱上(1．2 cm×50 cm)，一定质量浓度的唾液酸溶液进柱，再以1倍的去离子水洗脱，收集流出溶液，测定唾液酸含量． 1．2 5 阴离子树脂对唾液酸的动态吸附洗脱 一定体积的阴离子树脂装到柱上(1．0 cm×80 cm)，一定质量浓度的唾液酸溶液先进阳离子树脂柱，流出液偶联到装好的阴离子树脂柱，用3倍的水洗脱阳离子柱，然后撤去阳离子柱，用0～2 mol／L 的甲酸梯度以流速1. 0 mL／min(除特殊说明外)冼脱阴离子柱，部分收集器收集流出液体的唾液酸，测定各管唾液酸含量(室温下操作) 2 结果与讨论 2．1 树脂的筛选 2．1 1 阳离子交换树脂的选择 选择4种阳离子交换树脂(H )进行动态洗脱实验，比较唾液酸的收率情况．实验结果见表1． 从表1可以看出，唾液酸在TD031上的收率最高。D113是一种弱酸性阳离子树脂，因此它流出液的pH只降到2．2，但是它的唾液酸收率低。TD031是一种吸附能力强的强酸性大孔阳离子树脂，它有利于吸附盐和其他杂分子，所以选用TD031(H )树脂 2 I_2 阴离子交换树脂的选择 选择了8种阴离子交换树脂(HCCO一)进行静态吸附，比较了其对底物唾液酸的吸附量，结果见表2从表2可以看出，对唾液酸吸附量最大的是争光D314，其次是南开D290和中医717因为选用的洗脱剂是甲酸，甲酸浓度高对唾液酸的稳定性会产生影响，因此有必要对3种吸附量较高的树脂进行动态洗脱研究(用恒定0．35 mol／L甲酸洗脱)，结果见图2 从图2可以看出，D314树脂的洗出峰在后面才出来，说明其对唾液酸的吸附能力较强，需要较高的甲酸浓度才能洗脱出来，拖尾较严重；中医717树脂出峰较快，说明其对唾液酸的吸附能力较弱，且拖尾较严重；D290的出峰时间较为合适．峰型较为对称，如果用梯度洗脱，将有更好的峰形因此确定使用南开D290作为分离唾液酸的阴离子交换树脂． 2．2 吸附条件的选择 2．2．1 上柱清液pH对唾液酸分离的影响 测定上柱清液在不同的pH值条件下，唾液酸的分离情况见图3． 由图3可看出．3条流出曲线的形状比较接近 唾液酸的pH值在2 6左右，pH大于2．6有利于唾液酸解离成SA一负离子；又唾液酸溶液经过阳离子树脂柱时由于脱盐作用置换出H 离子，因此pH也不能选太低。另外碱性条件下唾液酸容易受到破坏．酸性条件下唾液酸的稳定性也受到影响．综合考虑，pH选择为4．5 2．2 2 上柱清液唾液酸质量浓度对唾液酸分离的响 配制不同质量浓度(pH 4．5)的唾液酸进行上柱实验，结果见图4． 由图4可以看出，随着唾液酸质量浓度的上升，洗脱峰也越高，但是拖尾也逐渐严重；从图4看，质量浓度太低或太高的收率都不高．质量浓度在中间的(15. 75 mg／mL)收率较高．因此选择上柱清液唾液酸质量浓度为15 .75 mg／Ml。 2．2．3 上柱清液流