2010硕士研究生分子物生学实验讲义.docVIP

分子生物学实验讲义 （硕士研究生试用） 山西医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学实验室 2010.6 实验一 动物组织蛋白质的提取 【目的要求】 1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。 2．了解动物组织蛋白质提取的原理。 【实验原理】 由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。【试剂器材】 实验小鼠 0.9%NaCl 动物组织蛋白裂解缓冲液 Tris 50mM NaCl 150mM EDTA 0.5mM DTT 1mM Triton X-100 1% 去氧胆酸钠 0.5% SDS 0.1% PMSF/异丙醇储备液 100mM（174mg/10ml）于-20℃储存 -20℃储存的冰块 【操作步骤】 1. 颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含预冷0.9%NaCl（6mL）的平皿中。 在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。 在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液（20μL/2mL）。 迅速将2mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。 将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，10min）。 离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。 所获蛋白提取液可保存于-20℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。 【注意事项】 在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态，以防蛋白质的降解。 实验二 蛋白质的定量（Bradford法） 【目的要求】 掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度，具有快速、灵敏的特点。 考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯-比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定可获得与其结合蛋白质的量。 【试剂器材】 1. 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于25mL甲醇中，加入800 mL蒸馏水，再加入 100 mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。 标准蛋白质溶液（1mg /mL）：牛血清白蛋白100mg，加0.9％NaCl至100 mL。 试管及试管架，吸管。 比色计。 【操作步骤】 标准曲线的制备：取5支试管，编号，按下表操作 编 号 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液 标准蛋白质溶液（mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （1mg /mL） 0.9％NaCl（mL） 0.8 0.6 0.4 0.2 － 蛋白质浓度 200 400 600 800 1000 （μg /mL） 另取6支试管，编号为0～5，按下表操作 编 号 0 1