第五章分子发光法试卷.ppt

* 三、装置与技术 instrument and technology 装置流程： 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大； * 生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。 （2）生成化合物的猝灭 基态的荧光物质 猝灭剂 （3）氧的猝灭 O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。 * 第五章 分子发光分析法 一、 仪器与结构流程 二、 荧光分析法和应用 第二节 分子荧光仪器组成及应用 * 厂家：美国瓦里安中国有限公司 型号： Cary Eclipse 价格：23万人民币； 仪器位置：教五221 分子荧光分光光度计 * 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 1. 分子荧光的基本原理 光致发光 发出光的强度与浓度成正比(If=kC) 基本原理 仪器组成 * 光源 样品池（比色皿） 激发光（入射光） 发射光（If） * 光源 氙灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理 仪器控制 发射单色器 1.荧光光度计仪器光路图 * 光源： 氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见-紫外区) 光源要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命 高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。 氙灯，是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，具有光强度大，在200～800nm 范围内是连续光源的特点。 染料激光器是一种新型的荧光激发光源。 * 单色器： 荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器，多使用干涉滤光片以获得纯度较好的“单色光”。第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤光片用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。 * 样品池： I0 It IF,p 荧光分光光度计,石英池？ 的样品池四面透光。 检测器： 现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。 * 2.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子效率Φ ： 由朗伯-比耳定律得： 荧光强度 If ： * 对于稀溶液，当 ?bC 0.05（磷光? bC 0.01）时： If ----荧光强度 I0 ----荧光强度 Φf ----荧光量子产率 b -- 吸收光程 ? -- 摩尔吸光系数 C -- 荧光物质浓度 Ip ----荧光强度 I0 ----荧光强度 Φp ----荧光量子产率 b -- 吸收光程 ? -- 摩尔吸光系数 C -- 荧光物质浓度 * （2）定量方法 标准曲线法： F Cs Fx Cx Fx F Cs Cx 直接荧光标准曲线法 荧光熄灭工作曲线法 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。 * 3.荧光分析法的应用 (1)无机化合物 无机化合物荧光分析有直接荧光法、荧光猝灭法、间接荧光法及催化荧光法等。 （a）直接荧光法 待测元素与有机试剂所组成的能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。 （b）荧光猝灭法 某些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但可以从其他会发荧光的配合物中取代金属离子或有机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量。 * (2)有机化合物和生物 具有荧光特性的有机化合物，生物、药物化合物可直接采用逆光荧光分析法测量。 目前研究热点： 激光诱导荧光研究溶液中单分子行为； 荧光分子作为探针研究DNA。