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实验四 抗药性突变株的分离 一、目的要求 二、基本原理 三、材料方法 四、操作步骤 五、实验报告 一、目的要求 1、学习用梯度平板法分离抗药性突变株。 2、了解基因突变的特点。 3、了解诱变育种的原则和一般步骤。 二、基本原理 基因中碱基顺序的改变可以导致微生物细胞的遗传变异。 微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。 在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变体就会在平板上长成菌落。经过挑取纯化，进一步进行抗性试验就可以得到所需要的抗药性菌株。 为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。 本实验采用梯度平板法分离大肠杆菌的抗链霉素突变株。 三、材料方法 1、菌株 大肠杆菌：Strs 2、培养基 LB固体培养基（底层和上层） 3、溶液或试剂 链霉素（100mg/mL） 4、仪器或其他用具 1ml无菌吸管，盛有70%乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等 四、操作步骤 1、接种大肠杆菌于 盛有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养24h。 2、在热水浴中溶化LB琼脂培养基。 3、倒10ml 已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。（图Ⅰ） 4、在已经凝固的平板低琼脂一边标示“100”，放回水平位置后，再在底层培养基上加入含有100ug/ml链霉素的LB琼脂培养基10ml。凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的0ug/ml到另一端100ug/ml的梯度平板。 5、用1ml无菌吸管吸取200ul 大肠杆菌培养液加到梯度平板上，涂布。 6、37℃倒置培养48h。 7、选择1~2个在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高浓度区域划线。 8、把平板37℃倒置培养48h。 五、实验报告 1、图示经一次培养和经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 2、试验中第7步，是为了测试这些菌株的抗性水平，你能设计几种不同的方法来测试这些菌株的抗性水平吗？ 3、培养基中的链霉素引起了抗药突变吗？请设计一个实验加以说明。 4、梯度平板法除用于分离抗药突变株以外，还有什么其他用途？ * * 梯度平板法(抗性突变株的筛选) Ⅰ底层不含药品 Ⅱ 上层含药品 Ⅲ 生长情况