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实验四 质粒DNA的提取 实验目的 掌握质粒提取的目的 掌握质粒提取的原理 掌握质粒提取得方法 一、实验原理 理论基础： 宿主染色体DNA与质粒DNA的区别 实验操作原理：三个基本步骤 细菌培养 裂解细菌以及质粒的初步分离 质粒DNA的纯化 理论基础：什么是质粒？ 细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独立于细菌染色体之外，能够进行自我复制。质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。 什么是质粒? 扩增 质粒DNA 细菌染色体 DNA 质粒 目的基因 宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别： 宿主染色体DNA 质粒DNA 分子大小 分子大 分子小 抽提结果 断裂成为线状 共价闭合环状结构 实验操作原理 分离质粒DNA包括3个基本步骤： ⑴ 培养细菌 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。 37oC 振荡过夜 ⑵ 裂解细菌以及质粒的初步分离 最普遍采用的方法是碱裂解法。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS溶液破坏细胞，再SDS与加入钾离子沉淀大分子DNA并离心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。 （3）获取高纯度质粒DNA的方法 密度梯度离心 CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度质粒DNA，但繁琐费时。 离子交换层析 DEAE离子交换层析利用DNA、RNA及蛋白质与DEAE基团间电荷作用的强弱差别分离 吸附层析法 玻璃珠吸附层析利用DNA在高盐浓度条件下与细小玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。 所用试剂的作用 质粒的快速抽提 溶液I含有RNA酶，水解RNA，并为低渗溶液，但由于细菌有细胞壁，因此不会破裂。 溶液Ⅱ中的SDS具有强烈的破细胞作用，使基因组DNA释放 溶液Ⅲ使基因组DNA与SDS及钾离子结合形成沉淀。 将含有质粒的上清加入到层析柱中，利用玻璃珠吸附层析分离质粒。 三、质粒抽提操作步骤 1.用接种棒取含有质粒的大肠杆菌接种于5ml含有抗菌素的LB培养液，37℃振荡培养过夜（已备）。 2.取1.5ml过夜培养物，加入1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液。 3.加入250μl溶液PⅠ，旋涡混匀，静置5 min。 4.加入新鲜配制的溶液PⅡ250μl并轻微颠倒混匀6-8次。 在进行混匀时不可振荡，以免基因组DNA断裂，对质粒的纯化造成污染。 5.加入溶液PⅢ 250μl并轻微微颠倒混匀6-8次。 6.离心12000rpm×10min，吸取上清液，收集于一个新离心管中。 7.将混合液加入放在套管的吸附柱内，离心12000rpm×1min，弃流出液。 8.向吸附柱加入漂洗液PW600μl，离心12000rpm×1min，弃流出液。 9.重复上一步。 10.将吸附柱放入套管，离心12000rpm×2min，将残余的漂洗液去除。 11.将吸附柱置入1.5ml新离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液或去离子水，室温静置2min，离心12000rpm×1min，收集流出液。 四、操作注意事项 加入溶液Ⅱ、Ⅲ时轻缓颠倒混匀，以免基因组DNA断裂，造成质粒污染。 EB具有极强的致突变能力，使用时需谨慎。 在本实验中使用了低毒性的GoldView I ，替代EB。 由于紫外线可造成视网膜严重损伤，因此不可用肉眼直接观察紫外灯。 琼脂糖凝胶电泳检测 制备1％琼脂糖凝胶: 凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品DNA分子长度调整。 溴乙锭是DNA嵌合剂，与DNA结合后经紫外光照射发出橙色荧光。 DNA溶液上样。 DNA上样量以观察到清晰条带为宜。一般每个样品孔100ng为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。加样量越少分离效果越好，但溴乙锭的检出灵敏度有限，单一条带的检测低限是2ng左右。 电泳。 在1％琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp左右DNA片段。根据样品中DNA片段大小，注意指示剂泳动位置。 紫外灯下观察结果。 紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm)激发的荧光强度高，对DNA损伤较大。长波(302nm)激发的荧光较低，但对DNA损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。 电泳步骤 制备1％琼脂糖凝胶: 用1×TBE电泳缓冲液配制1%琼脂糖溶液，微波炉中加热至溶化（2min）。稍等微凉，加溴乙锭2 ul，混匀并灌制事先备好的凝胶板。 点样： 取质粒DNA溶液5μl、上样缓冲液1μl，混匀，上样。 电泳 150V电泳30分钟，至指示剂泳动至凝胶前缘时停止电泳。 紫外灯下观察结果。 纯化的