分子生物学实验 Experiments of molecular biology.pptVIP

实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 【目的要求】 通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法 【实验原理】 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。2、 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。表达蛋白可经SDS检测。 【实验器材】 空气恒温振荡器，三角烧瓶，电泳仪，垂直电泳槽，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL），EP管，凝胶成像系统等。 【实验材料】 重组大肠杆菌，IPTG，甘氨酸电泳缓冲液，蛋白加样缓冲液，无菌水等，酚氯仿混合液，刀片等。 【实验内容】 1．外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 2．最佳蛋白收获时间的确定等 三、实验方案 1、外源基因的诱导表达( 1 ） 如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ； ( 2 ）如果表达载体的原核启动子为Lac,tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。( 3 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS 检测。 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 ）细菌的裂解常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 (1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。 ( 2 ）超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每克湿菌加3 mLTE 缓冲液。② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS 。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。 2 ）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。（1）试剂与配制① 洗涤液I：0.5 %?Triton X -100,10 mmol / L??EDTA ( pH 8 . 0 )溶于细胞裂解液中。② 2×凝胶电泳加样缓冲液。（2）细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min , 4 ℃ ；弃上清，沉淀用9× 洗涤液l 悬浮；室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min , 4 ℃ ；吸出上清，用100 μL 水重新悬浮沉淀；分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS。 3 ）包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制① 缓冲液I：1 mmol / L PMSF, 8mol /L 尿素, 10 mmol / L DTT 溶于前述裂解缓冲液中。② 缓冲液Ⅱ：50 mmol / L KH2PO4, 1 mmol / L