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关于腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒的研究 　　腺病毒(adenovirus，HAV) 是一种没有包膜的DNA 病毒， 基因组长约25～45 kb，1956 年由科学家Morris 在患有感冒的黑猩猩的鼻分泌中发现。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，HRSV) 是一种RNA 病毒，在1953 年被发现，属于副黏病毒科，主要有A 和B 两个亚型。博卡病毒(bocavirus，HBOV)是一种无包膜、单链DNA 病毒，基因组DNA 长度大约为5 299 nt。随着分子生物学检测方法的改进，2005 年8 月，瑞典科学家Allander 运用分子生物学技术，首次在儿童呼吸道分泌物中发现。腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒是世界范围内造成儿童急性呼吸道感染的重要病原体，对儿童的健康造成严重影响。因此，建立一种快速有效的分子诊断平台非常必要和迫切。越来越多的研究和实验证实，引起呼吸道感染症状的病原体往往是由多种病原体共同感染，混合感染引起的症状往往显著严重于单一病原体感染，特别是死亡或者超死亡病例都是由多种病原体混合感染的结果。传统的检测方法，一般情况下获得结果周期较长，而且每次实验只能鉴定一种病原体，不能满足快速应急的病原诊断，不利于即时采取措施控制传播，因此必须将快速而准确的检测技术应用于呼吸道病原体的检测，以为治疗疾病争取宝贵的时间。本研究应用近年来快速发展的荧光定量PCR 检测方法， 建立了一个快速检测腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒的三重荧光RT-PCR 体系， 能快速而有效地对腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒三种病原体进行判别和监测。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料、阳性对照及试剂 　　腺病毒、呼吸道合胞病毒及博卡病毒等呼吸道病毒为本实验室保存;Real-time One step RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa公司;病毒核酸提取试剂盒购自Roche 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 病毒总核酸提取取200 mu;l 病毒液， 按照viral RNA kit ( 德国，Roche Diagnostics GmbH) 提取病毒核酸，具体操作按说明书进行，然后测定回收的核酸浓度并计算出其拷贝数。 　　1.2.2 引物和探针的设计从GenBank 获得呼吸道合胞病毒、腺病毒、博卡病毒全长目的片段序列，利用MEGA 软件对其进行比对分析， 选定区域，利用引物和探针设计软件Primer Express 设计引物和探针序列，经过Blast 分析，得到具有特异性的引物和探针序列。引物和探针由大连宝生物公司合成。 　　1.2.3 一步法三重荧光RT-PCR 体系的建立采用TaKaRa 公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCRKit (Perfect Real Time) 建立25 mu;l 腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒三重荧光RT-PCR 检测体系。组分组成参照试剂盒说明书进行， 核酸用量为5mu;l。反应条件为42℃，10 min;95℃，10 s;95℃，5 s;60℃，1 min，40 个循环。60℃时采集荧光信号。仪器使用ABI ViiA7 荧光PCR 仪。 　　1.2.4 三重荧光PCR 检测体系的特异性、灵敏度和重复性实验灵敏度实验采用体外RNA 转录拷贝数进行，具体参见文献。荧光RT-PCR 特异性检验，以腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒和其他具有相似临床症状的呼吸道病毒(流感病毒A、流感病毒B、偏肺病毒、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、冠状病毒229E、鼻病毒和副流感病毒1-4 型)的核酸为模板，按反应体系和条件进行荧光RT-PCR 反应，以初步验证反应体系的特异性。重复性实验参照文献方法进行。按照反应体系和条件检测105～102 copies / mu;l 的体外转录RNA，每个浓度的样本平行做3 管，计算3 管平行样本的Ct 值间的变异系数。 　　2 结果 　　2.1 一步法三重荧光RT-PCR 方法的建立 　　利用设计的引物和探针， 建立了一步法三重荧光RTPCR体系对腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒进行检测。 　　2.2 三重荧光RT-PCR 检测体系的特异性 　　检测以腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒和其他具有相似临床症状的呼吸道病毒(流感病毒A、流感病毒B、偏肺病毒、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、冠状病毒229E、鼻病毒和副流感病毒1-4 型)的核酸为模板，按构建的反应体系和条件进行荧光RT-PCR 反应，结果表明只有腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒检测结果为阳性，其它呼