分析奇异变形菌ｐｐｋ１基因缺失株的构建.docVIP

分析奇异变形菌ｐｐｋ１基因缺失株的构建 　　奇异变形菌(PMI)为条件致病菌，也是医院感染的重要病原菌之一，可引起尿路感染、食物中毒、肺炎、心内膜炎、创伤及烧伤感染等，其中以泌尿系统感染最常见。PMI的多个毒力因子已得到鉴定，但其致尿路感染机制仍有许多未知之处，而且PMI耐药株的不断出现已引起研究者的高度重视。ppk1是某些细菌内负责催化ATP脱磷酸残基形成聚磷酸盐(Poly　P)的一种主要激酶，其由聚磷酸盐激酶1(ppk1)基因编码，主要负责聚磷酸盐的合成并参与ATP的代谢。有研究证实其与某些细菌致病性有重要关系，并参与了多个毒力基因的表达调控，然而它在PMI乃至整个变形菌属致病中的作用目前还处于未知状态。本研究利用自杀载体系统pCVD442构建PMI的ppk1基因敲除突变株，为进一步研究ppk1基因在PMI致泌尿系疾病中的作用打下良好基础。 　　1　材料与方法 　　1.1　材料 　　PMI(四环素抗性)菌株由密歇根大学医学院Harry　L.T.Mobley教授惠赠;大肠埃希菌SM10lambda;pir、自杀质粒pCVD442(氨苄西林抗性)均由美国南加州大学洛杉矶儿童医院黄胜和教授惠赠。 　　1.2　方法 　　1.2.1　ppk1基因上、下游同源序列的扩增　根据Pubmed上PMI的ppk1基因及其两侧DNA序列，设计合成两对引物PKP-AF、PKP-AR及PKP-BF、PKP-BR。以PMI基因组DNA为模板，分别PCR扩增ppk1基因上游801bp的A片段和下游787bp的B片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带正确后，利用胶回收试剂盒进行纯化，引物序列。 　　1.2.2　目的基因上、下游片段的连接　由于内侧引物PKP-AR、PKP-BF设计为反向互补，故可将ppk1基因两侧序列通过PCR融合、连接，将纯化后的上、下游同源臂片段按1∶1比例混合，以混合DNA片段作为模板进行融合PCR，引物对为PKPAF/PKP-BR。PCR反应体系和扩增条件同上，最后得到连接好的重组片段，纯化PCR产物。 　　1.2.3　同源重组质粒的构建　将质粒pCVD442和融合连接后的上、下游DNA片段分别用限制性内切酶Sal　I和EcoR　I进行双酶切并进行纯化回收。将酶切后的质粒和DNA片段按适当的比例混合，用T4连接酶16℃连接过夜，再将连接产物通过电转化方法转入大肠埃希菌SM10lambda;pir感受态细胞。转化产物在37℃、200r/min培养复苏1h后，取100mu;l转化菌涂布于LB平板(含50mu;g/ml　Amp)，置37℃培养箱培养过夜。通过PCR和Sal　I/EcoRI双酶切鉴定筛选出含有融合片段的重组质粒，鉴定引物为PKP-AF/PKP-BR。成功转化重组质粒的SM10lambda;pir菌株命名为SM10lambda;pir/pCVD442-Delta;pk1。 　　1.2.4　接合性转导与ppk1基因缺失株的筛选　将受体菌PMI　HI4320和供体菌SM10lambda;pir/pCVD442-Delta;pk1分别接种到5ml　LB培养液，37℃、150r/min培养至OD600约1.0(约6～8h)。随后取300mu;l供体菌与600mu;l受体菌混合(体积比1/2)，轻轻吹打混合后，6　000r/min离心5min，收集菌体，生理盐水洗涤2次，菌体重悬于LB培养液中，取100mu;l涂布于0.22mu;m滤膜(5cm直径，高温灭菌)上，菌液面朝上，置于无抗性LB平板表面，37℃培养过夜。之后用无菌生理盐水洗涤滤膜，将洗下的菌悬液涂布在LB平板(Amp、Tet双抗性)上，37℃培养进行第一次重组菌的筛选。将获得的一次重组菌在LB培养液中培养过夜，菌液适当稀释后涂布于含10%蔗糖的不含氯化钠LB平板上以筛选出二次重组菌。挑取单克隆菌落分别涂布于含有Tet(15mu;g/ml)和含有Amp(100mu;g/ml)抗性的LB平板上，37℃培养，挑选能在Tet(15mu;g/ml)LB平板生长，但不能在Amp(100mu;g/ml)LB平板上生长的单克隆菌进行PCR鉴定，鉴定引物pk-outF/pk-outR设计在基因组上打靶序列外侧。最后选取鉴定结果与预期一致的克隆子PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳回收后，用两侧引物pk-outF/pk-outR对其进行测序，测序正确的敲除株命名为△pk1。 　　1.2.5　野生株、缺失株体外生长曲线的测定　MOPS培养基中生长能力：从LB培养板上分别挑取野生株和敲除株的单菌落，并分别接种至5ml　LB培养液中，37℃振荡培养过夜后，从中取出1ml离心，清洗两遍，用1ml无菌PBS重悬，再取重悬菌液分别