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探究人脐带间充质干细胞生物特性比较 　　引言 Introduction 　　间充质干细胞是一类起源于中胚层的非造血干细胞，具有多向分化的潜能，能够为细胞治疗提供理想的种子细胞，同时也能作为基因治疗的载体细胞，目前已从骨髓、胎盘、脂肪、脐血、脐带、滑膜等组织器官中分离出间充质干细胞。体外培养的间充质干细胞形态均一，平行生长或漩涡状生长，能够表达多种表面抗原，如高表达间质细胞标志(CD44、CD90、CD105)，不表达造血干细胞标志(CD34、CD45、CD14)、内皮细胞标志(CD31、CD33)及人白细胞抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)等。在特定条件下间充质干细胞可以分化为成骨细胞、神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及肝细胞等。相比其他间充质干细胞，本实验选用的人脐带间充质干细胞具有种子细胞的很多优良特性，如增殖活性高、免疫原性低、无致瘤性等，且来源充足，无伦理问题。现阶段用于分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：贴壁组织块法、流式细胞仪分选法、胶原酶消化法及其改进方法等。每种方法各有利弊，贴壁组织块法原代培养时间较长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，但细胞活性保持良好。流式细胞仪分选法虽然所获得的细胞纯度较高，但实验成本较大，亦难获得足够的细胞数量。普通胶原酶消化法费用较高，虽然可在短时间内获得细胞，但常温中消化时间长可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁，不易传代;消化时间短液体较黏稠，难以离心获得足够量细胞。胰酶冷消化法曾用于培养乳鼠心肌细胞，与温胰蛋白酶消化法比较，胰酶冷消化法所需实验条件简单，因为不需搅拌和多次酶消化、清洗的烦琐过程，胰蛋白酶用量少，节约大量的人力物力，而且冷消化相对细胞活性损伤较轻。本实验首次采取胰酶冷消化法分离脐带间充质干细胞[23]，从细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物及诱导分化能力4个方面与传统组织块法比较，为不同需求的科研工作者获得较多的脐带间充质干细胞、更完整的细胞结构及其功能以满足实验要求并能达到更节约人力、物力提供一些资料。 　　1 材料和方法 Materials and methods 　　设计：对比观察细胞学实验。 　　时间及地点：实验于2013年6月至2014年3月在新疆医科大学干细胞研究室完成。 　　材料：足月健康新生儿脐带组织取自新疆医科大学第五附属医院妇产科，产妇及家属均知情同意，采集后装于盛有无菌生理盐水的50 mL离心管中，4 h内处理。 　　实验方法： 　　脐带间充质干细胞的原代培养：胰酶冷消化法：取足月健康新生儿脐带组织，剔除组织中的血管，用PBS反复冲洗去除血迹，剪碎至大小约1 mm3，放入50 mL离心管中，加入PBS离心(1 200 r/min)5 min，洗涤3遍，之后取离心后的组织块放入培养皿中并加入稀释后的胰酶(PBS与胰酶同比例混合)10 mL，用封口膜封死培养皿边缘，放入4 ℃冰箱过夜。第2天取出培养皿中的组织于50 mL离心管中，放入37 ℃水浴箱中15 min，之后加入L-DMEM用巴氏管充分吹打，静置1 min待组织块沉底后吸取上清液于15 mL离心管中。上述步骤重复操作2遍，尽量收集上清液，加入15 mL离心管离心(1 200 r/min)10 min，去除上清液加入含体积分数为20%胎牛血清培养液。混匀后加入培养皿中，放入37 ℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度条件下培养，每3 d换液1次。培养14 d左右，当细胞达到大部分融合时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养皿中，按上述方法继续培养。组织块培养法：取足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS洗涤数遍，去除残留血迹。把脐带剪切成4.0 cm左右的片段并剔除血管(1条脐静脉，2条脐动脉)，之后将其剪成大小约1 mm3的组织块，然后平摊置于55 mm培养皿中并加入2 mL胎牛血清加以固定。2 h后，按比例加入含有青链霉素、谷氨酰胺、维生素C及碳酸氢钠的L-DMEM培养基约8 mL，放置在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。每隔3 d半换液1次。观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80%-90%融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养皿中，按上述方法继续培养。 　　脐带间充质干细胞的生物学特性：细胞形态：两种方法培养的原代细胞通过普通倒置显微镜观察其形态变化。生长曲线：取上述两组第2代脐带间充质干细胞以每孔5times;103/cm2的浓度接种于24孔板中。采用胰酶消化锥虫蓝染色法，每日取4孔计数细胞，绘制细胞生长曲线，细胞达到生长抑制时停止实验。流式细胞仪检测细胞表面标记特征：胰蛋白酶消化第3代脐带间充质干细胞，1 200 r/min离心5 min，细