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玉米须对2型糖尿病模型大鼠降糖机制讨论 　　玉米须是禾本科玉蜀黍属植物玉米stigma maydis L.的花柱和柱头，含有甾醇、多糖、皂苷、黄酮等化学成分，具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等作用，民间常以玉米须做药茶用于糖尿病、高血压病的辅助治疗。目前，玉米须的降糖机制研究集中于其能够促进肝糖原、肌糖原的合成及保护胰岛细胞等功能，而对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)因脂质代谢紊乱诱发的胰岛素抵抗研究尚不充分。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是一种组织细胞分泌性基质蛋白，是引起胰岛素抵抗的一个诱因。本研究通过建立T2DM大鼠模型，考察玉米须对模型大鼠脂肪组织SPARC表达的影响，并观察胰腺病理结构的改变，探讨玉米须治疗糖尿病的作用机制。 　　材料 　　1. 药材与试剂 玉米须药材购于安国市奉义中药饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明教授鉴定为玉米须stigma maydis L.;链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司);血糖试纸(罗氏公司);RNA提取试剂(Trizol);RNA逆转录试剂盒(TaKaRa);PCR试剂盒(TaKaRa);SPARC及内参(beta;-actin)引物(Invitrogen公司);蛋白裂解液及BCA试剂盒(中国碧云天生物试剂公司);内参(beta;-actin)抗体及SPARC单克隆抗体(Abcam公司);内参二抗及SPARC二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);ECL显色试剂盒(英国安马西亚公司)。 　　2 . 仪器 AC C U- C H E K型血糖仪(德国罗氏公司);LineGene 9600聚合酶链式反应(PCR)仪(杭州博日科技有限公司);VersaDoc MP 5000凝胶成像仪(BIO-RAD公司);TY10170-3930型WESTERN BLOT湿法转膜仪(BIO-RAD公司);DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一公司);infinite M200PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)。 　　3. 动物及饲料 SPF级SD雄性大鼠，体质量(200plusmn;20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700049303;高脂饲料由实验室按如下配方配制：基础饲料79.5%、蛋黄粉10%、猪油10%、猪胆盐0.5%。 　　方法 　　1. 玉米须提取物的制备 　　称取玉米须500g，将其切短，用10倍量水室温浸泡10h，于80℃水浴中浸提2次，每次3h，过滤，合并滤液，于80℃减压浓缩并真空干燥，保存于-20℃备用。临用时，取适量加蒸馏水溶解配制成0.1g/mL的溶液。 　　2. 糖尿病模型的建立 　　参考文献方法。40只大鼠随机分笼，适应性饲养1周，期间自由进食基础饲料，自由饮水。除正常组(10只)给予基础饲料喂养外，其余大鼠给予高脂饲料喂养4周后，禁食不禁水16h，每只大鼠按35mg/kg剂量一次性腹腔注射2%STZ工作液(4℃预冷的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液新鲜配制，避光，pH值4.5)。正常组则注射相应剂量的柠檬酸缓冲液，分别于注射后3、7d测定空腹血糖，空腹血糖ge;11.1mmol/L维持3d者，确定为T2DM模型，不成模者弃去。 　　3. 分组、给药、取材 　　将造模成功的20只大鼠随机分为两组，即模型组和给药组，每组10只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，给药组灌胃给予玉米须提取物，给药量按照《中华人民共和国卫生部药品标准》1985年版一部规定的成人日用量最大30g折算成标准200g大鼠的给药量为2.7g/kg。给药组间，正常组给予普通饲料，模型组及给药组大鼠继续喂以高脂饲料4周至实验结束。连续给药4周后，通过每组大鼠尾静脉采血测定空腹血糖，然后用水合氯醛腹腔注射麻醉，分别取腹部脂肪组织立即置入液氮中，最后放入-80℃冰箱保存备用，另取各组大鼠胰腺，用滤纸吸干表面水分，立即放入10%甲醛溶液中固定用于病理组织检查。 　　4. 胰腺组织病理学观察 　　将10%甲醛固定的胰腺组织采用常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜检查，观察胰腺组织病理变化。 　　5. RT-PCR法检测各组大鼠脂肪组织中 　　SPARC mRNA的表达 取脂肪组织50mg，加1mL Trizol试剂提取总RNA。用酶标仪测定RNA的浓度和纯度，采用荧光定量PCR法检测不同组别大鼠脂肪组织SPARC mRNA表达水平。目的基因SPARC的上游引物序列：5’-GAA GGT ATA TGC AGC AAT GAC A