细谈熊去氧胆酸对胆汁淤积幼年大鼠的调控作用.docVIP

细谈熊去氧胆酸对胆汁淤积幼年大鼠的调控作用 　　他有毒的化学成分在肝脏和血液中聚集引起的综合征。活产婴儿胆汁淤积的发生率约为4 /10 000，如不及时治疗，可造成营养不良，影响患儿的发育和免疫功能，严重者将出现肝硬化和肝功能衰竭，是婴幼儿肝移植的重要病因之一。胆汁的形成和分泌与肝细胞基底膜/肝窦侧的转运系统密切相关。肝细胞毛细胆管膜上多药耐药相关蛋白2( Multidrug resistant associated protein 2，MRP2，大鼠基因表达为Mrp2) 和胆盐输出泵( Bile saltexport pump，BSEP，大鼠基因表达为Bsep) 分别负责非胆盐有机阴离子和胆盐的排泌，是胆汁酸盐分泌的主要转运体。两者的表达在胆汁淤积发生时有不同程度的改变。婴儿胆汁淤积的发病原因和机制与成人差别较大，常规的保肝药物治疗效果不佳。熊去氧胆酸( UDCA) 是目前使用最广泛的利胆药物，其作用机制为替换肝肠循环中的有毒性疏水性胆盐，抑制回肠对其他胆盐的吸收，其对胆汁酸转运体Mrp2 和Bsep 的调控作用尚不明确。本研究拟通过胆汁淤积幼年大鼠模型，从生化、病理和免疫组化以及分子生物学层面探讨UDCA 对肝内胆汁淤积幼年大鼠的治疗作用及其对Mrp2 和Bsep表达的调控作用。 　　1 材料和方法 　　1. 1 材料 　　1. 1. 1 实验动物以及分组SD 雄性大鼠24 只，SPF级，体质量150 ～ 180 g，购自南方医科大学动物实验中心，合格证批号SCXK( 粤)随机分为正常对照组( Normal 组) 、胆汁淤积模型组( ANIT 组) 、熊去氧胆酸治疗组( UDCA 组) 。动物实验方法符合南方医科大学动物实验伦理委员会的相关要求和规定。 　　1. 1. 2 主要试剂alpha;-萘异硫氰酸酯( ANIT，美国Sigma) ，熊去氧胆酸( 优思弗，德国福克大药厂，每粒250 mg) 。Mrp2 和Bsep 一抗购自美国SANTA CRUZ 公司，免疫组化其他相关试剂盒购自博士德生物公司，RNA 抽提以及荧光定量RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司。PCR 引物为上海生物工程有限公司合成。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 动物模型建立ANIT 组和UDCA 组大鼠给予ANIT 80 mg /kg 灌胃，每周1 次，共2 次，于实验第1 天、第8 天灌胃，Normal 组给予等剂量的芝麻油灌胃。UDCA 组给予熊去氧胆酸100 mg /( kg·d) 灌胃至实验结束，ANIT组和Normal 组给予等容量生理盐水灌胃。于第二次ANIT 灌胃后48 h，即实验第10 天处死大鼠，留取血液标本行肝功能检测，肝脏组织分两部分，一部分甲醛溶液固定，石蜡包埋切片行病理检查以及免疫组化分析; 另一部分置于- 70 ℃超低温保存拟行荧光定量RT-PCR 检测。 　　1. 2. 2 生化指标检测血液标本离心后取血清，应用贝克曼库尔特实验系统全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶( ALT) 、直接胆红素( DBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。 　　1. 2. 3 病理组织观察肝脏病理组织常规方法制作石蜡切片，HE 染色，光学显微镜下观察肝细胞以及胆管病理结构变化情况。 　　1. 2. 4 免疫组化采用SABC 法，参照试剂盒说明书进行。组织切片常规脱蜡水化后，EDTA 抗原修复液高温高压修复3 min，3 %过氧化氢灭活内源性过氧化酶，BSA 封闭多余抗体，Mrp2 和Bsep 按照1∶ 100 稀释，37 ℃ 孵育1 h，PBS 冲洗后加二抗孵育20 min，SABC 孵育20 min，DAB 显色，苏木素染核，在光学显微镜下观察显色结果。 　　1. 2. 5 Mrp2 和Bsep 基因表达测定RNA 提取参照试剂盒方法执行，琼脂糖电泳检测RNA 纯度，分光光度计测定RNA 浓度。实时荧光定量RT-PCR 检测参考试剂盒说明方法执行。PCR 引物为:Mrp2( 228 bp ) : 5-GCCACACTACACGGACTGAA-3’，5-ACCGATCAGCAACTTCAGCA-3’。Bsep( 225 bp) : 5-TCTCGTGGAGAGAACAACGCA-3’，5-CACCACTCCTTGTGACACGACA-3’。beta-actin( 154 bp) : 5-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，5-CCCATACCCACCATCACACC-3’。RT-PCR 反应条件为95 ℃预变性10 min 后扩增: 95 ℃15 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 15 s，共40 个循环。