详谈核酸染色剂ＳＹＢＲ－Ｇｏｌｄ染色特性.docVIP

详谈核酸染色剂ＳＹＢＲ－Ｇｏｌｄ染色特性 　　核酸染色在基因工程领域应用非常广泛，结合琼脂糖凝胶电泳可以分离、鉴定DNA片段大小，对于DNA浓度也可以根据荧光激发强度进行半定量。目前，对于凝胶染色的核酸染色剂，溴化乙锭(Ethidium　bromide、EB)仍然占据主导地位，EB可以结合双链DNA、单链DNA 以及RNA，EB结合双链DNA后荧光强度激发比游离凝胶中的EB发出的荧光强度大20-25倍，具备优越的DNA检测能力，在琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中可分别检测痕量的双链DNA。但是EB具有致突变性，对于环境安全有一定影响。随着对核酸染色剂研究的深入以及化学合成技术的发展，出现了一些经过改进的花青类核酸染色剂，相对于EB具有染色灵敏度高、环保、对核酸的结合具有选择性等特点。比如SYBR　GreenⅠ结合双链DNA能力远强于单链DNA 及RNA，因此可以作为实时定量PCR 的核酸染色剂，SYBR-Gold可以结合双链DNA、单链DNA及RNA，在结合双链DNA后具有2个荧光激发峰，一个位于300nm处，另一个位于495nm处，且对于核酸的检测能力均高于EB及其他SYBR系列的染色剂。而且安全、环保，已有文献报到SYBR　Gold在Ames实验中没有发现至突变性。但是SYBR-Gold试剂价格要远高于EB，为了降低使用成本，使用SYBRGold做前染色的优势报道越来越多，尤其是使用SYBR-Gold染色样品的前染色方式会极大的节约试剂的用量，而另有文献报道这种染色方式会使得DNA 迁移速度发生滞后。因此本文使用EB作为参照，使用后染色及前染色两种染色方式评估SYBR-Gold在检测双链DNA 的灵敏度以及染色特点，给选择使用SYBR-Gold以及适合这种染色剂的染色方式提供参考。 　　1　材料与方法 　　1.1　质粒与菌株 　　原核表达载体pXMCB-B2及菌种JM101为为本实验室保存。 　　1.2　主要试剂 　　PCR体系、分析级琼脂糖凝胶、质粒提取试剂盒购自Promega公司、凝胶纯化试剂盒购自生工(上海)生物工程有限公司、1kbDNA　ladder、100bpDNA　ladder、Gel　loading　Dye　6x 购自NEB公司，SYBR-Gold　in　DMSO 购自invitrogen公司;EB、DMSO购自Sigma公司，1xTBE缓冲液(final　concentrations　of　45 mmol/L　Tris-BoricAcid，2mmol/L　EDTA　PH：8.3)为实验室配置。 　　1.3　前染色及1%凝胶配置 　　称取0.6g琼脂糖溶于60ml　1xTBE缓冲液中，使用65℃水浴加热待琼脂糖全部融化，量筒分别量取30ml凝胶共2份，分别加入SYBR-Gold(10000x)3mu;l、EB(0.5mu;g/ml)3mu;l混匀后分别灌至6x6cm胶槽中，然后放置于室温约1小时待其凝固。后染色凝胶配置同前染色，但是凝胶中不加染色剂。 　　1.4　后染色 　　电泳结束后将不含染色剂凝胶放入1xTBE缓冲液的容器中，使凝胶完全侵入缓冲液，缓冲液中分别含SYBR-Gold：10000x、EB：0.5mu;g/ml，摇床低速染色40min。 　　1.5　电泳 　　将无染色剂凝胶放入同一电泳槽，含染色剂凝胶使用单独电泳槽在同一条件下分别电泳。电压1.5V/cm2，时间60min。 　　1.6　目的基因的扩增与纯化 　　使用实验室保存质粒为模板，使用特异性上游、下游引物扩增长度为711bp的目的基因，PCR反应程序为94℃预变性2min、94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1min;变性、退火、延伸共计25个循环;最后72℃延伸5min。测序正确后使用凝胶纯化系统进行纯化。 　　1.7　PCR产物的浓度测定 　　取2mu;l的PCR产物，使用Thermo公司的NanoDrop2000系统进行DNA浓度测定，然后将DNA稀释至25ng/mu;l冻存备用。 　　1.8　DNA　ladder浓度与SYBR-Gold浓度稀释 　　1kbDNA　ladder按照每6mu;l　8ng、16ng、35ng、63ng、125ng、250ng、500ng的浓度稀释配置备用;其中500ng从0.5kb到10kb每条带对应质量为42ng、42ng、36ng、48ng、125ng、33ng、42ng、50ng、42ng、42ng，其余浓度按照稀释倍数类推。SYBR-Gold按照1∶167、1∶333、1∶667、1∶1　000稀释于60%DMSO中，染色样品后SYBR-Gol