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调查肺炎克雷伯菌KPC一2酶的临床疗效 　　肺炎克雷伯菌是医院感染常见的病原菌，此类菌易产超广谱马一内酚胺酶(ESBLs)，也有携带质粒介导的头抱菌素酶(Amps酶)的报道碳青霉烯类抗菌药物具有抗菌谱广、抗菌活性强、快速杀菌的作用，常用于对此类菌的治疗。随着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，肺炎克雷伯菌对此类药物逐渐产生了耐药性，其常见的耐药机制如下:(1)高产酶合并膜孔蛋白缺失;(2)产生了水解碳青霉烯类药物的碳青霉烯酶;(3)青霉素结合蛋白(PBP)的改变;(4)主动外排系统的活跃oKPC酶是目前引起肺炎克雷伯菌耐药的主要原因。首次报道了KPC-1型(?oos年更改为KPC-2型)，世界各地陆续出现产KPC酶菌株，有报道显示中国分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯耐药主要以KPC-2酶为主。KPC酶在Buslz分类中属7f亚群141，Ambler分类中属于A类酶，其基因由质粒编码，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头抱菌素类和氨曲南等抗菌药物。这些菌株的出现常使抗感染治疗陷人无药可用的境地，患者死亡率很高。由于KPC酶基因位于可移动的质粒上，能够在不同菌种间水平传播而使细菌获得耐药性，容易在医院范围内引起爆发流行，在我国浙江地区已经流行，而东北地区尚无有关KPC酶的报道。本研究通过改良Hodge试验及对编码KPC-2酶的基因进行检测，了解中国医科大学附属一院住院患者分离的肺炎克雷伯菌产KPC-2酶的情况，现报道如下。 　　1材料和方法 　　1.1菌株来源 　　(1)实验菌株:根据CLSI判定标准:亚胺培南或(和)美洛培南的最小抑菌浓度2一4g mL或(和)抑菌环直径16一21mm，从临床分离出is株肺炎克雷伯菌，这株肺炎克雷伯菌分离自7个科室的1?华病人((6个ICU，呼吸内科、胰腺外科、感染科、内分泌科、烧伤科、神外各一例)，标本类型:痰、血、尿、腹水、引流液、导管、浓汁。 　　(2)质控菌株:ATCC2922(临检中心)阳性对照BAA170、阴性对照BAA 1706(北京大学第一医院临床药理研究所)。 　　1.2试剂 　　亚胺培南纸片(10/g)美洛培南纸片(10/g)厄他培南纸片(10林g)购自。mid公司MH琼脂平板(天津市金章科技)普通质粒小提试剂盒(TIANGEN)PCR引物(上海生工生物)TaqMi/(宝生物) 　　1.3仪器 　　Plzoeni/(BD，美国))VITEK2(法国生物梅里埃)低温高速离心机(AllegraX-22R , BE CKMAN，德国)PCR扩增仪(GeueAmp PCRSystem 9700(PERKIN ELMER，美国))电泳仪(POWER PAC300(BIORAD，美国))凝胶成像分析系统(Ultra-Violet Produot(UVP，英国))冰箱(Haier，中国) 　　1.4实验方法 　　1.4.1药敏试验 临床分离的标本经Plzoeni/或VITEK2上机鉴定并做药敏。 　　1.4.2表型检测 改良Hodge实验:0.，麦氏浊度单位大肠埃希菌ATCC2/922菌液作1:10稀释，均匀涂布MH平板，中间分别贴亚胺培南、美洛培南、厄他培南药敏纸片，将待测菌株、170(阳性对照),1706(阴性对照)用无菌接种环自纸片外缘向平板边缘划线，3/℃过夜培养后观察结果。结果判断:纸片抑菌圈内出现待检菌矢状生长者为碳青霉烯酶菌株。 　　1.4.3基因型检测 质粒提取:按照普通质粒小提试剂盒说明书提取Hodge实验阳J陛的两株肺炎克雷伯菌菌及170(阳性对照),1706(阴性对照)的质粒DNA PCR扩增体系:12.，/l TaqMi/,O.，/l KPC-R(Cgg AACCTg Cgg AgT gTA Tg),0.，/ 1 KPC-R(CAg CAg TTC AggCCA ACA CC),6.//1纯水，//l模板PCR反应条件:预变性94”C， min，变性94”C 30s退火61”C30s延伸72 “C 30s, 30个循环，再延伸72”C 7mino等点凝胶电泳:将PCR扩增所得产物进行电泳并染色成像。 　　2结果 　　2.1药敏结果 　　AMK 13”1，号耐药，其余敏感oATM均耐药。CAZ 7号敏感，其余耐药。CIP 3号中介，7号敏感，其余耐药。CZO均耐药。FEP均耐药。GEN 1,3,x,12号敏感，其余耐药。IPM 1,3,x,7,8,9,10,11,12号敏感，其余耐药。LVX 3,/号中介，6,7号敏感，其余耐药。MEM1,3,8,9,10号中介，x,11号敏感，其余耐药。 　　附:AMK一阿米卡星、ATM-氨曲南、CAZ一头抱他咤