谈17β-雌二醇对小鼠子宫DLL1 基因表达的影响.docVIP

谈17β-雌二醇对小鼠子宫DLL1 基因表达的影响 　　DLL1( delta-like1) 蛋白是DLL1-Notch1 信号通路的配体蛋白，通过作用于相邻细胞膜表面的Notch1 蛋白，发挥生物学效应。DLL1-Notch1 信号通路活性的异常改变多见于卵巢癌和乳腺癌等雌激素( Estrogen，E2) 依赖性相关肿瘤; 如长期雌激素刺激，可导致乳腺癌组织中DLL1-Notch1 信号通路的异常激活; 越来越多的研究表明DLL1-Notch1信号通路的不正常改变与多种疾病存在着密切的关系; 而DLL1-Notch1 信号通路的活性变化在雌激素依赖性的子宫肌层和内膜等子宫组织肿瘤中的研究较少。 　　1 材料和方法 　　1. 1 动物造模及总RNA 的提取由皖南医学院实 　　验动物中心提供昆明种雌性小鼠16 只( 25 plusmn; 5) g，随机分为正常对照组和去卵巢E2实验组，每组8只，动物自由进食饮水，自然光照，造模前禁食12 h，正常对照组不做任何处理，去卵巢E2实验组小鼠进行2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，去除双侧卵巢，按每天每千克小鼠体质量给予E2 1 mg( 美国Sigma 公司) ，即E2 1 mg /( kg·d) 的标准，对去卵巢E2实验组进行干预10 d，取两组小鼠子宫组织标本，采用TRIzol ( Invitrogen 公司) 一步法提取16 例子宫组织标本的总RNA，- 20℃保存。 　　1. 2 RT-PCR 反转录( RT) 合成cDNA 反应体系 　　中加入3 mu;l Oligo( dT)15Primer ( 0. 1mu;g /mu;l，Promega公司) 、2mu;l RNA，加ddH2O 至14mu;l，在PTC-150 型PCR 仪( 美国MJ 公司) 上70℃反应5 min，产物置于0℃; 3 min 后加入: 6mu;l 5 times; RT buffer、1. 5mu;l dNTPs( 10 mmol /L each，Promega 公司) 、0. 5mu;l RNasin ( 40U/mu;l，SABC 公司) 、1mu;l M-MLV ( 200 U/mu;l，Promega公司) ，加ddH2O 至30mu;l，于PCR 仪上42℃反应60min 得到cDNA，最后95℃ /5 min 灭活反转录酶。自行设计目的基因DLL1 与内参基因Gapdh 的引物序列，在NCBI 网站经Primer-Blast 中验证( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov /tools /primer-blast /) ，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列、产物大小及退火条件。 　　聚合酶链式反应( PCR) 体系: 2mu;l cDNA、1mu;l Taq酶( 2. 5 U/mu;l，北京天根生化科技) 、5mu;l 10 times; buffer、1mu;l dNTPs ( 10 mmol /L each，Promega 公司) 、DLL1或Gapdh 的上下游引物各0. 5mu;l ( 50 mmol /L) ，加ddH2O 至50mu;l; 循环条件为: 第一个PCR 循环94℃ /20 s 时加Taq 酶，98℃ 蛋白变性/5 min rarr;( 94℃变性/30 srarr;59℃退火/45 srarr;72℃延伸/60 s)times; 33 个循环rarr;72℃延伸4 minrarr;12℃结束反应，PCR产物- 20℃冻存。 　　2 结果 　　2. 1 电泳结果10mu;l PCR 扩增产物加样，在120V/65 mA 条件下，进行1. 5%琼脂糖凝胶( 溴化乙锭染色) 电泳，30 min 后在FR-200A 全自动紫外与可见分析装置( 上海复日科技有限公司) 下观察电泳结果，两组PCR 产物均出现目的基因DLL1 与内参基因Gapdh 的目标带。 　　2. 2 统计分析采用QuantityOne-4. 6. 2 凝胶分析软件，测定正常对照组与去卵巢E2实验组的DLL1基因与Gapdh 基因目标带的光强度( Adj. Vol. ) 值，运用SPSS 18. 0 统计分析软件进行两个独立样本间的t 检验，输出结果显示两组产物的目的基因与内参基因Adj. Vol. 的比值( 珋x plusmn; s) 分别为0. 33 plusmn; 0. 12、0. 78 plusmn; 0. 11，t = - 8. 14，如图2。去卵巢E2实验组DLL1 基因的表达水平显著大于正常对照组，其差别有统计学意义( P lt; 0. 05) 。 　　3 讨论 　　DLL1-Notch1 信号通路的配体蛋白DLL