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谈中药饮片鹿血晶PCR检测方法的建立 　　目前市场上含有鹿血的保健品有十几个品种，但是由于鹿血来源稀少及其珍贵的药用价值，所以市场上鹿血成分鱼目混珠，常用比较廉价的猪血、羊血、牛血等动物血以假乱真。传统的方法无法区分动物血的来源。DNA 核酸序列和特异引物PCR 扩增在动物药材鹿茸、鹿鞭、乌梢蛇、龟板、土鳖虫、蜈蚣等鉴定方面都取得了良好效果，但其在鹿血来源的应用还无相关报道。因此本研究为了鉴别中药饮片鹿血晶的真伪，建立PCR 检测方法。 　　1 材料和方法 　　1. 1 试剂DNA 提取试剂盒( 天根: TIANamp GenomicDNA Kit，吸附柱批号: M1104) ; DREAM TaqGreen Pcr Master Mix( 2 times; ) 12. 5mu;L( Thermo Scientific，批号: ; 引物序列见表1，由上海生工合成。 　　1. 2 药材梅花鹿血、牛血、猪血( 由苏州市红冠庄国药饮片有限公司提供) ; 鹿血晶1购于苏州市红冠庄国药饮片有限公司( 批号: 1211022) ; 鹿血晶2 购于合肥乐家老铺中药饮片有限公司( 批号 。 　　1. 3 实验仪器高速低温离心机: Thermo scientificBiofuge primo R; 凝胶成像系统: GEL DocTM XR +Bio RAD; 电泳仪: Bio - RAD Power Pac TM Basic;PCR 仪: AB AppLied Biosystems。 　　1. 4 方法 　　1. 4. 1 模板DNA 提取按试剂盒使用说明提取鹿血( 鹿全血约50mu;L) 、牛血( 牛全血约50mu;L) 、猪血( 猪全血约50mu;L) 和鹿血晶( 约15mg) 的基因组DNA。 　　1. 4. 2 PCR 反应体系在200 mu;L 离心管中进行，反应总体积为25 mu;L，DREAM Taq Green Pcr MasterMix ( 2 times; ) 12. 5 mu;L ( Thermo Scientific，批号 ，20mu;M 的引物各0. 75 mu;L，DNA 模板1. 25 mu;L，去离子水9. 75 mu;L。阴性对照为灭菌去离子水。阴性对照试验除反应中不加模板DNA 外，均按上述测定条件和步骤进行。 　　1. 4. 3 PCR 反应循环参数。 　　1. 4. 4 电泳检测称取适量的琼脂糖加入1 times; TAE缓冲液中，配置成质量浓度为1. 5% 的溶液，加热溶解，稍加冷却后，加入GeLRed 溶液至终浓度为0. 1mu;g /mL。制胶时将凝胶倒入盛有1 times; TAE 缓冲液的电泳槽中，垂直向上拔去梳版。吸取5 ～8mu;LPCR 扩增产物点样。其中一个泳道中加入DNA分子量标准品3 ～ 6mu;L 作用( 按试剂说明确定加样量) ，接通电源电泳，按5V/cm 的电压电泳30 ～60min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 　　1. 4. 5 结果判断凝胶电泳图谱中，待测鹿血晶在与梅花鹿血液对照品凝胶电泳图谱相应的位置上( 408bp) ，有单一DNA 条带为正品。 　　2 结果 　　2. 1 采用文献报道的鹿、牛和猪特异性基因片段引物，用鹿、牛和猪的全血提取基因组后进行PCR 扩增，扩增后电泳结果。它们各自PCR 产物的大小分别为鹿408bp，牛271bp 和猪149bp。 　　2. 2 用鹿特异性引物，扩增不同动物血液来源基因组结果见图2。可见该引物对鹿血具有特异性。其不能扩增出牛和猪血的特异性条带，而对鹿血和鹿血与其它动物血的混合物( 两者1∶ 1混合) ，能扩增出特异性条带。 　　2. 3 不同来源鹿血晶PCR 扩增结果见图3。选取市场上两个生产厂家的鹿血晶，经PCR 检测，均检出鹿特异性目的条带。 　　2. 4 不同含量鹿血晶PCR 扩增结果。称取不同量的鹿血晶，进行基因组DNA 提取，提取后进行PCR 扩增，发现当鹿血晶的含量为1. 51mg 时( 为常规用量十分之一左右) 仍能扩增出目的条带。 　　3 讨论 　　中药饮片鹿血晶为纯梅花鹿或马鹿血制成，其性热、味甘咸，具有养血益精，行血祛瘀、消肿疗伤等作用。现代研究表明，鹿血制品含有丰富的造血干细胞和多种造血因子，包括G - CSF、GM - CSR、M - CSF 等。目前市场上鹿血成分鱼目混珠。有关鹿血的鉴别，虽然有免疫学抗原抗体沉淀法、聚丙酰胺凝胶电泳等方法报道，但由于方法繁琐等原因，这些方法未能得到广泛应用。本研究选用的引物，针对《中华人民共和国药典》规定其正品为鹿科动物梅花鹿或马鹿的