谈小剂量辣椒素对大鼠内脏机械及化学刺激敏感性的影响.docVIP

谈小剂量辣椒素对大鼠内脏机械及化学刺激敏感性的影响 　　近年来，功能性胃肠病(functional gastrointestinaldisorders， FGIDs) 的发病率正逐年上升， 但其发病机制仍不清楚， 大量研究显示内脏高敏感在FGIDs 发病机制中有着关键作用。随着辣椒素(capsaicin， Cap) 缓解疼痛的作用被逐渐认识，Cap 对FGIDs 内脏高敏感的研究越来越多。一些学者研究发现初次或短期使用Cap， 并不能立刻发挥镇痛作用， 相反， 还会引发或加重疼痛。随着使用时间的延长， Cap 才能逐渐展示其镇痛效果[1]。Cap通过刺激初级传入神经元末梢和细胞膜上的特殊受体而产生作用， 此受体称为辣椒素受体(TRPV1)。Cap 可通过激活消化道内TRPV1 的表达而影响内脏的高敏感性， 但Cap、TRPV1 和内脏高敏感的相互作用目前还不完全清楚。因此本研究通过喂食大鼠Cap 饲料， 研究连续摄入小剂量Cap 在不同时间点对不同性别大鼠内脏化学和机械刺激敏感性的影响。 　　材料与方法 　　实验动物清洁级SD 大鼠160 只， 雌雄各80 只，体重180 ~ 200 g， 饲养2 周以适应环境。药品与试剂Cap (99%浓度， 美国Sigma 公司);10FR 导尿管; 动物用新斯的明注射液; 兔抗大鼠TRPV1 多克隆抗体; 二步法免疫组化检测试剂(PV- 6001); DAB 显色试剂盒等。Cap 饲料的配制每日新鲜配制， 99% Cap 1 mg，加入到普通饲料粉100 g， 充分混匀成形， 即得到Cap 浓度为10 mg·kg-1 的Cap 饲料。实验分组及分期SD 大鼠160 只， 随机分为对照组与观察组， 每组80 只， 雌雄各半。对照组摄入普通饲料; 观察组摄入Cap 饲料， 剂量为Cap1 mg·kg-1·d-1。每组再随机均分为5 小组， 分别观察给予Cap 后1 d、3 d、1 周、2 周和4 周的改变， 对应观察时间， 每小组大鼠16 只， 雌雄各半。内脏机械刺激敏感性测定采用直肠气囊扩张法。诱导大鼠排尽直肠内粪便， 石蜡油涂抹肛周，10FR 导尿管气囊端置入大鼠直肠， 胶布固定于尾部， 采用5 mL 空针向气囊内匀速注气， 边注气边观察腹痛相关行为即大鼠腹部撤离反射行为(abdominal withdrawal reflex， AWR)， 当大鼠行为达到AWR 评分的4 分， 结束注气， 记录气囊内注入的空气体积即气囊扩张的体积。AWR 行为评分标准： (1) 在给予刺激时， 大鼠情绪基本稳定，评为0 分; (2) 在给予刺激时大鼠变得不稳定，偶尔扭动头部， 评为1 分; (3) 大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部并未抬离地面， 评为2 分; (4)大鼠腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面， 评为3 分; (5) 大鼠腹部肌肉强烈收缩， 背部成弓形并把腹部、骨盆及会阴部抬离地面， 评为4 分。内脏化学刺激敏感性测定采用腹腔注射新斯的明方法。大鼠空腹状态， 用1 mL 注射器向腹腔内注射新斯的明注射液， 浓度为60 mu;g·mL-1， 剂量为120 mu;g·kg-1。注射完毕放入0.5 m2 干净饲养箱，立即计时， 观察大鼠行为变化， 记录到大鼠开始出现AWR 评分ge; 3 分时的时间， 为化学刺激开始时间; 从化学刺激开始时间到大鼠行为首次恢复AWR 评分lt; 3 分时间， 为化学刺激持续的时间。免疫组化法观察胃、十二指肠组织TRPV1 的表达取大鼠胃、十二指肠组织各一块， 固定包埋，采用二步法免疫组化染色检测TRPV1 的表达， 严格按照试剂盒说明行免疫组化染色。采用彩色病理图像分析软件分析， 计算阳性指数(PI)， PI =阳性信号面积times;平均吸光度值divide; 测定面积， PI 值越大， 表示TRPV1 释放越多。统计学处理结果采用SPSS 19.0 统计软件分析，计量资料以x plusmn; s 表示， 各组数据先进行独立性、正态分布及方差齐性检测， 多组样本均数之间比较当方差齐时采用双因素方差分析， 方差不齐时采用秩和检验。检验水准alpha; = 0.05， P lt; 0.05 为有显著意义。 　　结果 　　一般情况所有大鼠精神状态良好， 行动灵活，食欲佳， 皮毛光滑， 大小便正常。Cap 对大鼠内脏机械刺激敏感性的影响与对照组相比较， 喂食Cap 1 周， 观察组大鼠气囊扩张体积显著减少(P = 0.002)， 且雌性较雄性对气囊扩张实验更敏感(P = 0.001); 相反， 喂食Cap 4 周，观察组大鼠气囊扩张体积显著增加(P = 0.007);而喂食1 d、3 d、2 周观察组与对照组之间差异无显著意义(P gt; 0.05)， 见