海洋微藻多糖提取纯化条件的研究.docVIP

海洋微藻多糖提取纯化条件的研究 吴　曼, 李文权, 张赛金, 陈清花 ( 厦门大学海洋学系、亚热带海洋研究所, 福建 厦门　361005) 摘　要: 研究了提取介质、超声条件和洗脱条件对海洋微藻多糖提取纯化效果的影响。 实验结果表明不同pH 的提取介质可以提取得到不同种类的多糖, 超声条件以 300 W、20 min 最佳, 用葡聚糖凝胶 Sepha dex- G200柱(长 50cm, 直径 2 cm) 纯化粗多糖, 当加样量为 4 ml, 用 0. 2 mo l/ L NaCl 溶液洗脱效果最好。 关键词: 海洋微藻; 多糖; 提取纯化 　　海洋微藻富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、多糖和维生素等生物活性物质。海洋微藻多糖不同于陆生高等植物多糖, 其中硫酸多糖具有独特的化学结构和药用价值。例如螺旋藻多糖虽然仅占微藻干重的10% [ 1], 但由于其特殊的化学结构而具有独特的药用价值。Hayashi[ 2- 4]等用热水从螺旋藻中提取一种新型硫酸多糖 ( Ca- SP) , 具有显著的抗病毒活性。因此, 加快海洋微藻生物活性物质的开发可以弥补陆地植物及大型海藻药用特性的不足。目前对海洋微藻多糖的研究远不及陆地植物和大型藻类多, 国内此类研究报道极少。本文以海水小球藻( MarineChlorel la )、球 等 鞭 金 藻 ( I sochry sisgalbana) 为研究对象, 研究了海洋微藻多糖的提取、分离纯化条件, 建立了海洋微藻多糖提取纯化的最优方法, 为进一步认识和开展海洋微藻多糖研究提供了实验基础。 1　材料与方法 1. 1　材料 海水小球藻藻种引自厦门大学生物系, 球等鞭金藻藻种引自厦门大学海洋生物实验室, 按F/ 2 配方在生化培养箱中培养, 光暗周期为12 h/ 12 h, 取指数生长期的藻液离心过滤, 60℃烘干, 研磨成粉末。 1. 2　主要仪器和试剂 无水乙醇、 蒽酮、三氯乙酸、 丙酮均为分析纯试剂, 葡聚糖凝胶Sephadex- G200 为生化试剂, 凝胶柱长50 cm, 直径2 cm。主要仪器为VCX600 型超声波细胞破碎仪 ( SM Inc, U SA) 和LD4- 2 离心机 ( 北京医用离心机厂) 。 1. 3　多糖提取纯化工艺流程 干藻粉称重, 加入提取介质后超声破碎, 于80℃水浴提取1 h。离心取上清液, 3 倍体积无水乙醇沉淀, 加3%三氯乙酸溶解沉淀, 再用3 倍体积无水乙醇沉淀。丙酮洗涤沉淀, 烘干沉淀得到粗多糖。粗多糖经 Sephadex- G200 柱层析, 洗脱后获精多糖。碳水化合物含量用硫酸- 蒽酮比色法测定[ 5]。 2　结果和讨论 2. 1　不同提取介质对多糖提取的影响 分别采用4%NaOH、 蒸馏水和盐酸( pH= 3) 作为介质对海水小球藻提取和分离纯化。不同提取介质对海水小球藻多糖提取率的影响见表 1。超声条件为功率450 W, 超声时间20 min, 脉冲9. 9 s、间隔3. 3 s。柱层析纯化条件是加样量 3 ml, 以0. 2mol/ L NaCl 溶液为洗脱液。由表1 可知, 超声破碎协同稀碱法的粗多糖提取率远大于相同超声条件下的蒸馏水法和盐酸法, 但稀碱法得到的粗多糖经葡聚糖凝胶柱分离纯化后, 精多糖提取率有明显的降低, 表明稀碱法提取多糖容易引入杂质。比较3 种介质条件下提取的精多糖含量可知, 超声协同蒸馏水法相对提取率较高, 得到的粗多糖的杂质含量较低。不同提取介质下所得粗多糖经Sephadex- G200柱纯化, 洗脱曲线见图1、2、3。由图可知, 用稀碱提取可得到两种精多糖分别为ADT 1 和ADT 2, 而水提和酸提都只得到一种精多糖, 分别命名为WDT 和HDT。经气相色谱和红外光谱分析可知,ADT 1 和 ADT 2 都是均多糖。ADT 1 由葡萄糖组成, ADT 2 由半乳糖组成, 并且均含有乙酰氨基, 但都不含硫酸基。 WDT 和HDT 均为杂多糖, WDT 由鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7 种单糖组成, HDT 由鼠李糖、 阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6 种单糖组成, 都含有乙酰氨基和硫酸基。这说明不同的提取介质可以提取得到不同种类的多糖, 这与Ray[ 6]提出的在同一种溶剂作用下多糖很难被完全提取的结论相符。 　表 1　不同提取介质下海水小球藻多糖的提取率 介质 4%NaOH 蒸馏水 盐酸( pH= 3) 粗多糖/干藻重( %) 25. 20 4. 24 1. 87 精多糖/干藻重( %) 2. 57 3. 12 1. 32 精多糖/粗多糖( %) 10. 2 73. 6 70. 6 2. 2　超声条件优化实验 海洋微藻多糖主要