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优选菌株对三种有机磷农药降解效率的研究 作者：余云涛 宋泱 王 凯 指导老师 曾国寿 摘要 从被农药污染的土壤采集样品，在不同农药浓度下富集耐农药的微生物。对菌株进行分离与筛选、耐农药能力的测定、菌落计数，优选了耐药能力较高的A、B、C、E、F、G六个菌株，并对菌株进行了微生物学鉴定。研究了这六个菌株的降解有机磷农药情况，结果表明：菌株C对辛硫磷的耐受性较强，但A和E对辛硫磷的降解率较高，48hr后的降解率达到了65.6%和76.1%；菌株B、C对甲基异柳磷的耐受能力较强，但菌株E、F和A对甲基异柳磷的降解活性较强，48hr后的降解率分别为77.5%、74.5%和63.8%；菌株E对.水胺硫磷的降解活性最高，48hr后降解率高达91.2%。采用A，E，F混合菌株接种培养48hr，对辛硫磷，甲基异柳磷，水胺硫磷的降解率分别为82.3%，84.7%，93.5%。 6个菌株的对硫磷水解酶基因PCR结果表明，菌株A、C、F、G四株芽孢杆菌能扩增出预期的900bp条带。细菌破碎液对有机磷农药的降解及其pH值的实验结果表明，E菌株内含有降解有机磷的酶，不属于已被克隆的对硫磷水解酶，它的基因序列至今未见报道；建议改为：E菌株内含有降解有机磷的酶，但未能扩增出对硫磷水解酶的900bp条带，所以它可能由其他的酶参与有机磷的降解。B菌株耐受性很强，其B菌株内不含对硫磷水解酶改为：但同样未能扩增出900bp的条带。E的较适pH为7.2，A、B、F的较适pH为8.0。 关键词 优选菌株 有机磷农药 降解效率 引言 有资料表明我国每年有机磷农药的使用量约为8万吨。它们的广泛使用是造成环境污染和食品污染并威胁人类生存与可持续发展的主要原因之一，并成为发达国家贸易绿色壁垒的重要手段[1]。在土壤和水体中，微生物对有机磷农药的降解起着重要的作用[2~4]。因此，驯化和分离具有高效降解有机磷农药的微生物，并探讨农药污染的生物修复的可能性，消除农药污染，净化环境具有重要的现实意义。 材料和方法 细菌的富集 从厦门后坑菜园地分别采集施用过辛硫磷、多菌灵和敌敌畏的土样三份。分别取1g土样加入100 mL含有10 ppm、50 ppm、100 ppm辛硫磷乳剂的LB培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g ，NaCl 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0~7.2）中，28℃震荡培养48 hr，以富集耐受或分解辛硫磷的细菌。 1.2细菌的分离与筛选 上述富集后的培养物以倾注法分离单菌落。分离后的细菌分别接种到含100 ppm、200 ppm和500 ppm的辛硫磷、甲基异柳磷和水胺硫磷LB平板上，28℃恒温箱中培养3天后，观察细菌的生长情况，选择耐受谱广、耐药性强、生长旺盛的菌株。进一步考察验证采用含上述不同浓度的不同农药的LB斜面培养基，28℃培养3天。 1.3耐药能力的测定 上述筛选后得到的菌株，进一步考察了它们在不同农药浓度下的生长情况。在含有100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm、1500 ppm的甲基异柳磷、辛硫磷乳剂、水胺硫磷的液体LB中加入1 mL菌悬液，28℃震荡培养48 hr后，以蒸馏水为空白，以无接菌的含不同浓度的不同农药的LB液体培养基为对照，测定OD600。 1.4菌落计数实验 用5mL无菌水洗下菌苔，取1 mL菌悬液加入9 mL含有浓度为100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm辛硫磷的液体LB培养基中，摇均后放在28℃摇床中培养3天后，稀释10-6、10-7倍，分别取稀释液0.1 mL至培养皿中，倒入温的固体LB培养基摇匀，在28℃恒温箱中培养3天后，观察各平板中菌落的生长情况，记录菌落数量、大小、颜色和形态，得出各个细菌的耐受浓度范围。 1.5菌株的鉴定 1.5.1菌落形态观察 在LB平板上划线，培养后观察菌落形态。 1.5.2 革兰氏染色和镜检 经革兰氏染色后，以枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为对照，油镜观察。 1.5.3 BioLog MicroLog3自动微生物鉴定系统鉴定： ⑴将活化后的细菌接种于LB平板，产芽孢菌株需进行十字划线培养。 ⑵30℃培养18hr后，以无菌棉签将不产芽孢菌株菌落从平板上轻轻抹下，悬浮于预加19 mL GN/GP-IF（0.4.% NaCl、0.03%聚醚 F-68、 0.02% Gellan Gum）接种液的Turbidity Standard（BioLog公司）浊度管中, 在Turbidimeter 浊度计 （BioLog公司）上测定比浊为20%T；以无菌竹签将产芽孢菌株菌苔轻轻刮下，注意选取接种十字外侧菌苔，将挑下菌苔涂布于干的Turbidity Standard浊度管内壁，并将其尽量涂布成膜状，加入19 mL