第9章重组DNA技术.ppt

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第9章重组DNA技术

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 探针来源 已克隆的基因片段 PCR、RT-PCR等方法扩增的基因片段 人工合成的DNA片段(寡核苷酸) 细胞中分离的RNA 分子杂交是基因芯片技术的基础。两条互补的核酸分子在一定条件下通过氢键作用而相互结合,形成双链DNA分子。当其中的一条核酸分子带有可检测的标记时,能形成特异性结合的分子就被检测出来 基因芯片中探针被有序地固定在固相支持物上,当基因芯片与带标记的待检测分子在一定条件下发生反应后,发生特异性结合的探针位置就被确定,根据探针分子的种类就可确定待测样品中是否含有某种特异的分子。在进行分子杂交前须对靶DNA分子进行扩增以提高反应的灵敏度,然后对靶DNA进行标记 样品的标记方法:荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等 * * 基因芯片杂交 基因芯片杂交后必须用扫读装置将芯片的反应结果转变为可供分析处理的图像数据,该扫读装置就是芯片扫描仪。目前商业化的芯片扫描仪有激光共聚焦芯片扫描仪、CCD芯片扫描仪等。在获得图像数据后借助计算机对结果进行分析和处理 对生物芯片扫描数据的采集、处理、分析和报告是生物芯片技术中的一个重要环节,它由复杂的计算机来完成。生物芯片是在一块载体上集成了数千或数万个点的识别分子,每个点相对应于一段特异的核苷酸序列和杂交测定的光密度值。对芯片数据处理包括芯片图像分析和数据的提取、芯片数据统计学分析和生物学分析等。扫描得到的图像文件已经是数字文件,但还没有得到各样品点的光密度值、面积和光密度比等数据,必须通过图像处理提取各样品点的数据。扫描获得的信号包括样品信号和背景信号 * * 基因芯片的扫读与分析 * * DNA芯片技术的应用 DNA序列测定 基因表达分析 基因诊断 新药筛选 临床用药 * * 以蛋白质代替DNA作为检测对象,直接在蛋白质水平上检测基因表达情况 先将各种蛋白质有序的固定于载玻片等介质上做成待检测的芯片,然后,用标记有特定荧光物质的抗体与芯片作用,最后通过分析芯片点上的荧光强度来分析蛋白质之间的相互关系,同时也能判断出各种基因表达功能的目的 蛋白质芯片 * * II. Maxam-Gilbert化学修饰法 I. Sanger双脱氧链终止法* III. DNA自动测序 * * Sanger双脱氧链终止法 双脱氧终止法是由 Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法,也称为引物合成法或酶促合成法 原理:利用DNA聚合酶合成DNA,在DNA的聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序 反应的终止依赖于底物2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。在DNA聚合酶作用下能通过其5’三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中,形成磷酸二酯键,但由于缺乏3’羟基而不能同后续的dNTP或ddNTP形成磷酸二酯键,因此,一旦ddNTP掺入DNA的新生链中,聚合反应就会终止 * * 待测DNA模板,可以是单链也可以是双链 DNA聚合酶Ⅰ(常用Klenow片段) 原料:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP),其中一种带P32或S35放射性标记 脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂:2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 引物:一段寡核苷酸片段, 通用引物(一般含15-30bp ) 反应主要成分 * * 在实验中设4组反应体系,每一体系中加入4种 dNTP混合物和一种ddNTP。反应时,ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中,使DNA链延伸终止,并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低,所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后,将会合成不同长度的DNA片段 在含ddATP 的反应管中,DNA片段均以ddATP结尾。同理,含ddGTP、ddCTP或ddTTP的反应管中,DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾 脱氧核苷酸链延伸的终止 将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp, 放射性自显影,从胶片上,直接读出单链DNA的核苷酸顺序 反应物 A G C T 模板DNA + + + + 引物 + + + + 4种dNTP + + + + ddNTP ddATP ddGTP ddCTP ddTTP 聚合酶 + + + + 缓冲液 + + + + * * ssDNA dsDNA * * * * 获得待测DNA片段的单链模板: 一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与M13载体进行重组,然后将其导入大肠杆菌进行增殖, M13载体一般以单链DNA形式透出细胞

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