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等高图和密度图 流式细胞仪的组成和工作原理 液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。 光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号 电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现 流式对照的设置 荧光染色对照的设置1 阴性对照 空白对照 自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强 实验样本 特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光 同型对照（自发荧光＋非特异荧光） 合适？ 同型对照 同型对照（Isotype Control） ： 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即Fc段相同， F(ab’)2段不同） 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE 商业化荧光素的发射光谱 spectral overlap Fluorescence Spectrum Viewer spectral overlap 如何解决？ 荧光染色对照的设置2 补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时） 荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号 已染色样本？ 真双阳？假双阳？ 荧光染色对照的设置2 补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时） 荧光补偿（compensation） 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色 ※几色分析需要制备几个补偿对照管 分析类型 管 功能 加入的抗体 双色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE 4 Sample1,2…… A-FITC B-PE No. Antibody Isotype Mouse anti-human 未免疫Mouse 血清纯化而来 1 A-FITC（γ1） γ1-FITC 2 B-PE（γ2a） γ2a-PE 双色荧 光补偿1 FL1单染补偿管 双色荧 光补偿2 FL2单染补偿管 上机检测 单色/双色/多色样本 参数调节 电压 阈值 设门 补偿 流式细胞仪的应用领域 临床研究: 血液、肿瘤、药理、免疫…. 生物学研究： 遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物…. 环境研究： 海洋生态研究…. 制药工业 食品工业 农业畜牧业 更多资源 谢谢！ * * * * * * * * （每个细胞上的抗原不同，一个一个细胞讲） * 时间有限， BD Biosciences Immune Function BD公司生物科学部 流式基础原理 流式基本概念 流式细胞术的基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞术的特点 检测速度快，分析样本量大： 在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞