酶组织化学概论22039幻灯片.pptVIP

根据偶联的时间不同，将偶氮色素法分为两种。 1）同时偶联法 同时偶联法是在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。 2）后偶联法 后偶联法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。 3.色素形成法 （1）四唑盐法 四唑盐法是指含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形成红色或蓝色的甲 （formazan）或二甲 （diformazan）色素。该法主要证明各种脱氢酶。 三、电镜酶组织化学证明法 1．氧化还原酶 （1）四唑盐法 四唑盐是水溶性的，在水溶液中几乎无色，还原后则难溶于水和脂质，变成有色的高电子密度的甲 。现在最常用的四唑盐有NBT和TNBT等。 （2）高铁氰化物还原法 本法是金属盐法的一种，高铁氰化物作为人工受氢体而被使用。高铁氰化物接受由酶作用而游离出来的氢，从而变成亚铁氰化物，此物质不溶于水，并以电子密度高的亚铁氰化铜的形式在酶活性部位被捕捉而沉着。 琥珀酸 ――――――→延胡索酸 琥珀酸脱氢酶 Fe(CN)63- ――――――→ Fe(CN)64- 高铁氰化物 亚铁氰化物 Cu2+  ――――→ Cu2Fe(CN)6·XH2O 亚铁氰化物 特异性底物：5’-腺苷酰-亚氨二磷酸 cATP + PNP（亚氨二磷酸）ATP-PNP  无水解作用 2.去底物对照 用去底物的无底物孵育液进行反应，确认反应的消失或明显减弱。 3.酶活性丧失对照 实验用过长时间固定或恒温60℃处理60min的方法，使酶活性丧失后进行孵育反应。 4.阳性对照 事先不知某种组织细胞是否存在某种酶的活性，可用已知有活性的组织或细胞做对照，以确定待测组织或细胞内有该酶活性的存在。 环化酶 ATP酶 * 酶组织化学概论 酶是一种具有催化活性的特殊蛋白质。人体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系。 国际生物化学酶学委员会已登记的酶有2200多种。但当前组织化学技术所能显示的酶仅200多种。 酶组织化学是用组织化学的方法证明酶的存在，它的基础是组织化学，目的在于阐明组织细胞内的化学反应、功能及其生物学意义。 一、酶的分类 1.氧化还原酶 是催化氧化还原反应的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混合功能氧化酶。 2.转移酶 即催化功能基团转移的酶。此大类可根据底物中被转移的基团性质分为8个亚类。其中第6亚类为转移含氮基基团的酶，如天门冬酸转移酶。 3.水解酶 即催化水解反应的酶，称为水解酶。水解酶又可根据其与水解反应有关的键的类型进一步分为亚酶类，如酯酶、糖酶和肽酶。 4.裂解酶 又称裂合酶。促进一种化合物分成两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物的酶类。它可使底物移去基团，如 H20、C02，并出现双键。此类酶的亚类比较多，一般表示分裂的基团，如其中第1亚类为裂解C-C基团的酶，如草酰乙酸脱羧酶；第2亚类是裂解C-O基团的酶，如脱羧酶等。 5.异构酶 催化同分异构体的相互转化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶等。 6.合成酶（又称连接酶） 系指能将两种物质合成为一种物质，并必须与ATP分解相偶联的酶。 二、光镜酶组织化学证明法 1．金属-金属盐法 金属盐法一般是指金、银、铜、铁、铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的分解产物和金属多半可以结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位，就可以证明某种酶的存在。 酶作用于底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应局部，然后使其显色。其反应式如下： Pb2+ (NH4)2S  R-PO4Na2 + H2O ――→ ROH + PbHPO4↓――→ PbS 酶反应 显色 这种方法在底物溶液中的H+浓度为中胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。通常称本