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土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 土豆磷酸化酶的分离及直链淀粉的酶合成 化学生物学实验 6学时 5. 思考题 2. 实验原理 3. 仪器与试剂 4. 实验步骤 1. 实验目的 2.实验目的 6学时 （1） （2） （3） 酶（土豆磷酸化酶）的分离 酶合成（直链淀粉） 酶活性测定 化学生物学实验 化学生物学实验 6学时 2.实验原理 2.1 土豆磷酸化酶的分离原理 （硫酸铵分级沉淀法，盐析法的一种） 化学生物学实验 6学时 1.实验原理 2.2 直链淀粉的合成原理 化学生物学实验 6学时 1.实验原理 2.3 检验磷酸根的原理 （酶活性测定原理） 无机磷酸根与钼盐的硫酸溶液可生成磷钼酸。磷钼酸可氧化metol（4-甲氨基酚硫酸盐），而这一氧化反应会发生从黄到蓝的颜色变化。此时可测定溶液的吸光度变化。氧化反应后溶液中的磷酸根量可通过与校正曲线的对比进行测定。 + 颜色由黄变蓝 3.仪器与试剂（1） 仪器与试剂 化学生物学实验 6学时 2.5Kg土豆、削皮和切土豆用的一把刀、一个粉碎机、一台离心机和离心管（1L）、10g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、一台可控温搅拌器、一个搅拌子和一个三角瓶（2L）、1Kg硫酸铵、水和一台天平 土豆磷酸化酶分离所需 1.1g葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐二水合物，7mg麦芽七糖、3g枸橼酸氢二钠倍半水合物、3g枸橼酸三钠二水合物、一个pH计、适于冷冻和加热到100℃和离心1mL水溶液的离心管，一支移液器（1mL）、一个存储液氮的杜瓦瓶、一个加热快（100℃）、一台离心机、1mol/L三乙醇胺缓冲液、100mL水、20mL的2.5mol/L硫酸、20mL5%钼酸铵水溶液、0.2g硫酸对甲氨基酚、0.54g亚硫酸氢钠和一台UV光谱仪并带有适当的比色杯 直链淀粉合成和比色法测定所需 3.仪器与试剂（2） 0.54g亚硫酸氢钠 20mL的5mol/L硫酸 20mL的5%钼酸铵水溶液 磷酸盐试剂 （用于磷酸根浓度的比色测定） 6学时 化学生物学实验 含有0.2g对氨基酚硫酸盐的100mL水溶液 混合物至少搅拌30min 4.实验步骤 用于酶法合成的沉淀 沉淀 上清液 土豆泥 土豆 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 1.粉碎 2.打成匀浆 1.加硫酸铵 2.离心 1.溶于水 2.加硫酸铵（350g/L) 化学生物学实验 6学时 1.离心 2.调pH至7.0 3.55℃搅拌40min 4.加硫酸铵（100g/L) 5.离心 4.实验步骤 STEP 1 STEP 2 STEP 3 STEP 4 将2.5Kg土豆去皮，切成小块在粉碎机中打成匀浆。匀浆在5000r/min离心30min，将上清液用Tris缓冲液调至7.0，并在55摄氏度加热40min 将上述混合物冷却至室温，按每升液体加入100g固体硫酸铵 搅拌30min并在5000r/min离心后，再按每升液体250g硫酸铵加入上清液中。 搅拌30min，离心，并收集沉淀置于500mL蒸馏水中，并向其中加入175g硫酸铵。搅拌30min，离心（10000r/min，30min）分出酶 化学生物学实验 6学时 4.1 分离纯化土豆磷酸化酶的步骤 4.实验步骤 进行反应 生成产物 产物检测 葡萄糖-1-磷酸酯 + 引物 直链淀粉 + Pi 比色法测定 化学生物学实验 6学时 P.PH 4.2 直链淀粉的合成及比色测定 从葡萄糖-1-磷酸酯酶法合成直链淀粉的反应图示 4.实验步骤 2.将1.1g（2.9mmol）葡萄糖-1-磷酸酯二钾盐水合物和7mg麦芽七糖溶于50mL上述枸橼酸钠缓冲液，并加热至45℃。 3.将300mg酶溶于上述2mL枸橼酸钠缓冲液中，加入其中后，每30min从反应混合物中取1mL并立即冷冻保存于液氮中。刚加入酶后即采第一个样品。整个测定过程需要5-6个样品。 4.样品100℃加热10min后离心，取100μL上清液加入2.9mL的1mol/L三乙醇胺缓冲液中，向其中加入7mL的磷酸盐试剂。15min后于578nm测定吸光度。 1.将0.1mol/L枸橼酸氢二钠与0.1mol/L枸橼酸三钠溶液混合，得一pH6.0缓冲液。 使用同一比色杯测定！ 6学时 化学生物学实验 5.思考题 1 3 2 简述硫酸铵 分级沉淀法 纯化土豆磷 酸化酶的原 理 检验磷酸根 的原理 直链淀粉的 酶合成原理 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室