生物化学-第3章-氨基酸教材.ppt

（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂 1.血液凝固中的级联过程 12中蛋白质凝血因子有7种是丝氨酸蛋白酶 * * * * * * * 与Ca2+结合促进凝血酶原与血小板膜结合，起始凝血酶原的激活 带净负电荷 五、肽与蛋白质的人工合成 （一）肽的人工合成 氨基和羧基的保护 羧基的活化 常用的缩合剂是O,O′-二环己基碳二亚(O,O′-dicyclohexyl-carbodiimide,DCC) （二）固相肽合成 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ? ? L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu ? 短杆菌肽S(环十肽) ?由细菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。 三、蛋白质一级结构的测定 (一)蛋白质测序的策略 1.确定蛋白质的纯度在97%以上。 2.测定多肽链的数目。 3.拆分多肽链。 4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。 5.鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。 6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 7.测定各肽段的氨基酸序列。 8.拼接各肽段成完整的多肽链。 9.确定二硫键的位置。 (二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 1.N-末端的测定 （1）二硝基氟苯(DNFB )法 (Sanger法):2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 （2）丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到1?10-9mol,比DNFB法灵敏100倍。 （3）异硫氰酸苯酯(PITC)法: N末端氨基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）–AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定 。 （4）氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。 2.C-末端的测定 （1）还原法。C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 （2）肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 （3）羧肽酶法。将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。通常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。 （三）二硫桥的断裂 巯基化合物还原法 过甲酸氧化法 （四）氨基酸组成的分析 一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。 蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。 （五)多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 肽段的分离纯化可用层析法或电泳法 可以用酶水解法或化学水解法将蛋白质水解成肽段 溴化氰断裂法 羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键. 1.Edman化学降解法: 用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.99