实验酪蛋白的制备.ppt

实验 PCR基因扩增 生物药学 目的 通过本实验了解并掌握PCR反应的原理与实验技术。 原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。 PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 仪器及试剂 1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳仪等 2.试剂： 10X PCR 缓冲液配制（部分随Taq酶提供）： 250～500 mmol/L KCl 100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4） 15～20 mmol/L MgCl2 0.5% Tween-20 1mg/L BSA 其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖凝胶等 操作步骤 1. PCR 体系（40ul）： 4ul 10XPCR 缓冲液 4ul 25mM MgCl2（根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定） Xul 模板DNA ≥50ng 1ul 上游引物（50-100ng） 1ul 下游引物（50-100ng） 1ul dNTP Mixture（终浓度20－200uM） 0.4 ul Taq聚合酶 加ddH2O至40ul 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。 3. PCR反应热循环程序设置： （1） 95℃ 300s 变性 （2） 94℃ 45s 变性 （3） 55℃ 45s 退火 （4） 72℃ 45s 延伸 重复步骤2-4共 30 循环 （5） 72℃ 600s 延伸 反应结束后短暂离心，吸取少量（10ul）进行分析，其余置4℃保存备用。 4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 注意事项 1. PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。 2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 3.Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。 * * *