重组DNA技术与基因工程2课件.ppt

噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ GGGCGGCGACCT 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，其本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 – 37） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度 10 kb （51 – 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 – 26） l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株中后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA及其重组分子的分离纯化： 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA l-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA 噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。 考斯质粒（cosmid）