124三氯苯生物降解菌株的分离和降解质粒的初步研究.pdfVIP

————一蔓三曼至竺篓型兰鲎塞茎墅兰查堕!鲎鱼兰 l，2，4一三氯苯生物降解菌株的分离和降解质粒的初步研究 束营王慧施汉晶胡洪营 清华大学环境系环境模拟与污染控制国家重点实验室 T研究背景 氯苯化合物被广泛用作溶剂、杀虫剂、农药、防霉剂、油漆、溶剂、薰蒸剂等，并是制 造多种染料和化学药物的中间体。实践证明：它们的广泛使用会对人体健康可造成严重的影 响和对生态系统构成严重的威胁，对人类会产生较强的致畸、致癌、致突变的作用。氯苯类 化合物中的一氮苯、二氯苯、l，2,4-三氯苯、五氯苯、六氯苯等是毒性很高的化合物。美国环 要成员。在自然界中存在着许多具有降解有机污染物的微生物菌株，新的降解细菌菌株的分 离对于环境微生物资源开发及基因工程菌的构建均具有重要的实际意义。 2研究方法 2．1菌株的驯化和分离 试验中用的培养基为无机盐培养基和LB营养培养基。 菌落后，挑取单菌落在含有高浓度底物底培养基中驯化，从培养出的菌落中挑选生长较快的 菌株，进行多次平板划线分离，最终得到纯菌。试验中所用的试剂均为分析纯。2．2氧离子 含量的测定 用离子色谱法。在测定之前，样品要经过0．45帅微孔滤膜过滤。 2．3菌株抗性试验 将菌株接种于含不同抗生素的营养固体平板上，30℃，培养24h，观察和定量测定菌体生 长情况，以确定其抗性。试验中用的抗生素为氯霉素(Cm)工作浓度为300¨g／mL、四环素 u p (Tc)工作浓度为200 g／mL、卡拉霉素(Km)工 g／mL、氨卞青霉素(Ap)工作浓度为800 u 作浓度为50g／mL。 2．4质粒提取与质粒DNA转化 提取质粒，检测并转化到E．eoliJMl09中，方法详见《分子克隆实验指南》。 3结果与讨论 3．1菌株的分离 经过多次单菌落接种和驯化后，从数十株菌落中筛选出四株抗污染物能力强且生长迅速 的菌株。菌株号暂定为H，T8，T10，T16。菌落形态和革兰氏染色结果为：T4为革兰氏阳性． 长杆，菌落圆形，表面湿润有光泽，无色透明；T8和T16为阴性，都为短杆，菌落圆形，T8 表面无光泽，菌落呈乳白色；T16菌落表面湿润，灰色，半透明；T10染色结果有待进～步确 定，菌落圆形，无色透明。 3．2菌株对底物的降解能力 l，2．4一三氯苯的降解机制主要是先氧化开环再脱氯．所以可以通过测定降解过程中释放 出来氯离子的燕来检测不同菌株对1，2，4-三氯苯的降解能力。试验菌液中1．2，4-三氧苯的浓 mM；T10：01)=0．1 氯离子的浓度为2．04蒯；T4：01)=0．218，氯离子浓度为1．27 13．氯离子浓度 1 20删；T8：OD=0．297，氯离子浓度1．74。 一185— 第三届_环境模拟与污染控制学柬研讨会论文 图1氯离子浓度及菌体浓度随时间的变化 图20D值随时间变化 3．3菌株对抗生素的抗性 通常在环境中分离的菌株对抗生素具有一定的抗性。 表1菌株对抗生索的抗性 T16 一 + 一 + “一“表示不能生长，“+“表示可以生长 结果表明：根据抗性试验得到T16有KM和AP两种抗性，T8没有抗性，T4只有KM 抗性，T10有CM和AP两种抗性。 3．4降解质粒的分离 M1‘23 4 5 6 7 8 9 10M2 许多重要的氯代芳香化舍物的降解基因位于质粒 上。我们从4株降解菌株中分离质粒，电泳结果如图 所示。其中： l—lO为不同菌株的质粒提取结果，其中l：