人β干扰素血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分必表达.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 人p干扰素一血清白蛋白融合 蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 雷楗勇， 张莲芬， 杨健良， 金 坚’ (ix南大学生物工程学院教育部工业微生物重点实验室，无锡214036) 摘 要：利用重叠PCR技术在体外拼接IFNp和HSA基因，将得到的融合基因插入到毕赤 酵母分泌型表达载体pPICgK中，置于启动子AOXI和d交配因子信号肽的作用下，分泌表 Western 的抗原性；用细胞病交抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU／n1L． 关键词：8干扰素；巴斯德毕赤酵母；融合蛋白 干扰素(InterferonIFN)是一类具有抗病毒、抗增殖和免疫调节等生理活性的细胞因 子，主要分为I型和II型两类。IFN8属I型，和IFNa共用同一受体，它是由成纤维细 胞分泌的一种糖蛋白，由166个氨基酸残基组成，分子量为22—23kDa。用于临床的IFNB 主要有两种：IFNB—la和IFNB一1b，其中IFNp-la为天然的IFN口；IFNp—lb为由原核系 统表达的IFN8，其Cysl7为Ser所代替。由于IFNB分子量较小，易被肾小球滤过，因 而在体内的半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在8h左右。为了达到治疗 效果，一般需要频繁大剂量用药，如隔日一次，每次8×106IU，而多发性硬化症等疾病的 治疗周期较长，频繁大剂量用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生毒副 作用。为了克服上述缺点，人们通过对干扰素加以修饰，以延长其半衰期。主要方法是： ①在干扰素剂型上加以改进做成缓释剂型，以延长其在体内的作用时间，改善其生物利 用度；②利用化学手段修饰，该方法通过向干扰素中引入多聚大分子(如PEG，葡聚糖等) 以增大其分子量，从而减小干扰素经肾的排泄，达到延长干扰素半衰期的目的；③利用基 因工程手段，将其与其它无酶活性人源性大分子蛋白融合。由于干扰素缓释剂型大都存 在制作工艺繁琐、干扰素活性损失和在体内有突释效应等问题，要制备理想的干扰素缓 释剂还需要大量的研究[2’3]；PEG修饰的干扰素存在不均一、修饰位点难以控制和大分子 的PEG在体内可能蓄积等缺点，基于方法③研制的长效蛋白越来越受到人们关注。 人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg／mL，血浆半衰期 在20d左右，在体内主要起维持血浆渗透压、作为内源性和外源性物质载体等作用[4]，作 融合蛋白载体使用不存在免疫源性和机体毒性问题。本研究利用基因工程手段将8干 通讯联系人：Tel：0510- E--mail．jinjian31@hotmail．o．om 雷楗勇等：人8干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达 777 扰素与人血清白蛋白进行融合。以分泌型表达质粒pPIC9k为载体，通过这一载体将拼 接后的IFN8一HSA基因整合到巴斯德毕赤酵酵母染色体中，筛选得到高拷贝遗传稳定的 重组子，并在分泌信号肽的作用下分泌表达融合蛋白IFNp—HSA。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1质粒、菌株、病毒和细胞株毕赤酵母Pichiapastoris DH5a和克 II 隆载体pBluescript 聊SH细胞，由苏州大学杨吉成教授惠赠。 I、Not 1．1．2工具酶与试剂DNA聚合酶pfu、dNTP、限制内切酶EcoRI、T4DNA 连接酶、酵母抽提物、蛋白胨、酵母氮基YNB均购自上海生工，欣化诺重组人干扰素a一2b 生物制品所，其余试剂均为分析纯试剂。 1．1．3引物 上引物由华大中生科技发展有限公司合成。Pfl和Pf2用于扩增IFN 8基因，Pf3和Pf4 用于扩增HSA基因。 1．2方法 1