westernblot操作步骤2012版.doc

Western Blot基本概念印迹技术 1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。 概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA,RNA，蛋白质的检测。 蛋白质免疫印迹法 Western blotting: 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。 应用 1 检测样品中特异蛋白存在与否 2 细胞中特异蛋白的半定量分析 3 蛋白质分子相互作用的研究 实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS； 4 蛋白质的转移； 6 目的蛋白质的检测。 免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 测定相对含量时，需要内参照 选择合适的反应条件：SDS胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择 注意电极的正负极 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 操作要轻柔。western blot操作步骤2012版2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的western条带了，所以相信你也行。为了节省时间，鄙人总结了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。 背景： 蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。 一、蛋白质的样品制备： 由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题: 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。 二、蛋白质定量 如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在4冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。 三、SDS－PAGE电泳 1