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免疫磁珠富集净化-超高效液相色谱法同时测定陈皮中4 种黄曲霉毒素 化学工程与技术 文献信息 DOI：10.3724/SP.J.1123.2015.06001 作者： 邢言言，佟玲，陈楠，于治国，赵云丽 作者单位： 沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳,110016 天士力控股集团研究院药物分析所,天津,300402 刊 名： 色谱 Journal： Chinese Journal of Chromatography 年，卷(期)： 2015, (12) 分类号： O658 关键词： 免疫磁珠，超高效液相色谱法，黄曲霉毒素，陈皮 Keywords： immunomagnetic beads ( IMBs )，ultra performance liquid chromatography ( UPLC)，aflatoxins( AFs)，Citrus reticulatablanco 摘要： 将ＰｒｏｔＥｌｕｔ ＮＨＳ（Ｎ-羟基丁二酰亚胺）偶联磁珠与抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体偶联得到黄曲霉毒素总量免疫磁珠，其具有较好的分散性，良好的磁性能和特异的选择性。 实验结果表明，4 种黄曲霉毒素在各自的线性范围内峰面积与其质量浓度线性关系良好，相关系数（ｒ2）大于0.999；检出限（信噪比为3）为0.013~ 0.038 μｇ／ｋｇ，定量限（ 信噪比为10）为0. 044~1.2 μｇ／ｋｇ；平均回收率为63.9％ ~115.0％ ，相对标准偏差为0.4％ ~ 14.2％ ，均符合痕量分析的要求。该方法简单快速、准确可靠，可用于陈皮中4种黄曲霉毒素的测定。 背景 黄曲霉毒素（ ＡＦｓ）是由黄曲霉和寄生曲霉在繁殖过程中产生的一类分子结构相似的次级代谢产物，被世界卫生组织（ＷＨＯ）的癌症研究机构（ ＩＡＲＣ）划定为Ⅰ类致癌物。 致癌物的等级可分为第一级(Group 1)致癌物、第二级A类(Group 2A)致癌物、第二级B类(Group 2B)致癌物、第三级(Group 3)致癌物三个级别。黄曲霉毒素属于第一级致癌物 黄曲霉毒素的产生： 目前报道的ＡＦｓ有20多种，中药材在采收、贮存、加工和炮制过程中处理不当易被ＡＦｓ 污染，较常见的有黄曲霉毒素Ｂ1（ＡＦＢ1）、黄曲霉毒素 Ｂ2（ＡＦＢ2）、黄曲霉毒素 Ｇ1（ＡＦＧ1）、黄曲霉毒素 Ｇ2（ＡＦＧ2），其中 ＡＦＢ1 的毒性最强。 黄曲霉素是黄曲霉菌属黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，剧毒，同时还有致癌、致畸、致突变的作用，主要引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。 在紫外线下黄曲霉毒素B1，B2发蓝色荧光黄曲霉毒素G1，G2发绿色荧光。 《中国药典》2010 年版一部规定陈皮、桃仁、酸枣仁、僵蚕和胖大海5 味药材需进行ＡＦｓ 检测，其中ＡＦＢ1 限量为5 μｇ／ｋｇ，ＡＦＢ1 ＋ＡＦＢ2 ＋ＡＦＧ1 ＋ＡＦＧ2 限量为10 μｇ／ｋｇ。 黄曲霉毒素的检测过程 AFs的前处理： ＡＦs的前处理方法主要包括有机溶剂萃取法和免疫亲和色谱法等。 有机溶剂萃取法存在过程复杂、毒性大、耗时等缺点，且最终提取物中易存在其他荧光物质、色素、结构类似物，会对检测结果产生干扰。 与有机溶剂萃取法相比，免疫亲和色谱法提高了试样的净化效率，且减少了有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，对操作人员的技术要求较高。 免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术是20 世纪70 年代后期发展起来的一项与磁载体结合的免疫学技术，它同时具备了免疫学反应的高度专一性以及固相化试剂所特有的优点，已广泛应用于分离及浓缩特定细胞、微生物、蛋白质和核酸片段等肉眼难以观察或样品中含量不高的物质。 免疫磁珠分离技术的原理 免疫磁珠分离技术的原理是内含Ｆｅ3Ｏ4 的纳米磁珠的表面修饰官能团与抗体结合构成免疫磁珠（ＩＭＢｓ），免疫磁珠富集净化体系的作用力是外界磁场，磁性纳米颗粒在磁场中可定向运动，从而在反应结束后能利用磁铁实现反应体系和未反应体系的快速分离，避免了繁琐的过滤或离心过程，且消耗溶剂少，操作简单，大大缩短了前处理时间。 AFs的检测方法 酶联免疫法、薄层色谱法、荧光分光光度计法、ＨＰＬＣ 法、ＵＰＬＣ 法及ＬＣ-ＭＳ 联用法等。 酶联免疫法适用于ＡＦｓ 的快速筛查，但重复性差，假阳性出现率较高； 薄层色谱法由于灵敏度低及重复性差，目前应用较少； ＨＰＬＣ 法是目前应用最多的定量检测方法，但由于ＡＦＢ1 和ＡＦＧ1 与水接触后会产生荧光淬灭现象，原有较强的荧光特性基本消失，分析时一般需要柱前或柱后衍生，检测步骤增加，造成分析速度较慢，耗费有机溶剂较多，费时费力。 ＬＣ-ＭＳ 联用法能够同时进行定性和定量分析，能有效排除假阳性结果，但仪器昂贵，不易推广。 ＵＰＬＣ 法借助于ＨＰＬＣ 法的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低