对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP24的定位研究.pdf

福建蠹f) 第三届海洋生钧育技术论坛 200s．08．19-23 对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP24的定位研究+ 谢希贤+，杨丰‘ 国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门361005 摘要：对虾白斑综合症病毒是造成琼虾大量死亡的主要病原。VP24蛋白是病毒粒子的一个 主要的结构蛋白。当纯化的病毒粒子经去污剂处理后，VP24蛋白被发现完全存在于囊膜部 分，Western杂交实验也证实该结果，以上实验结果表明VP24蛋白是病毒的一个囊膜蛋白。 利用免疫胶体金定位技术对该蛋白的进一步研究中发现，核衣壳上未见标记的金颗粒，完整 的病毒粒子上标记的金颗粒也很少，而囊膜部分破损的病毒粒子上却可观察到大量的金颗 粒。我们认为VP24蛋白是一个囊膜蛋白，但是它的主体可能存在于病毒的囊膜和核衣壳之 间。 关键词：对虾白斑综合症病毒；VP24蛋白；囊膜蛋白 1993年以来，在我国及东南弧沿海养殖对虾中连年爆发流行性病毒，造成巨大的经济损 失。研究表明其主要病原是一种新型的无包涵体的类杆状双链环状DNA病毒——对虾白斑 综合症病毒(WhiteSpot Virus，WSSV)[1,2】。目前病毒基因组全序列已经测定，是一 Syndrome 个功能基因。VP28、VP26和VP24是病毒粒子中含量最丰富的三种结构蛋白。这三种蛋白 的基因在序列上具有较高的同源性，被认为是来自同一个基因祖先I引。通过免疫胶体金颗粒 标记实验，VP28已经被证实定位在病毒的囊膜上【6l。VP26被发现与病毒的囊膜和核衣壳都 有联系，它很可能介于病毒的囊膜和核衣壳之间作为一个连接蛋白【7l。VP24最初被认为是一 个核农壳蛋白I5I，但未经证实。本文对VP24在病毒粒子中的定位进行了研究，为进一步阐 明该蛋白的功能打下基础。 1材料和方法 1．1材料 实验用原始病毒提取自厦门同安对虾养殖场收集的感染阳性对虾。螯虾购于厦门第八市 coli XLl．Blue和E．coli TaKaRa公司产品，Taq酶为本实验室制备。菌株E BL21(DE3)为本 标记的羊抗鼠二抗为华美公司产品。其余试剂均为分析纯。 +课题资助：国家“863”资源和环境领域课题(2003AA626020) 作者简介：谢希贤(1976-)，男，博i卜研究生。 +通讯作者。Email：mbiotech@public．xm．0．cn 481 覆建曩n。 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19—23 1．2方法 1．2．1 pET—His—vp24表达质粒的构建： vp24的基因编码的蛋白N端包含一个很强的疏水区，推测可能是蛋白的穿膜结构域。为 了使重组蛋白可溶表达，在重组表达的VP24中去掉了这段疏水区，即只表达VP24的26—208 氨基酸序列。根据已测定vp24基因序列合成以下引物(括号内所示为引入的划线部分的酶切 下游引物 45 50 2 S，54口30S，72D ulPCR反应液中95f23min变性后，经25个循环扩增(94口30 s)。 coli感 产物和pET．His载体用BamHI和EcoRl双酶切，酶切产物经胶纯化后连接并转化E 框正确。 1．2．2重组VP24蛋白的表达纯化：