负载HER―2的树突状细胞诱导T细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究.docVIP

负载HER―2的树突状细胞诱导T细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究 　　摘要：目的 研究用HER-2抗原负载树突状细胞诱导T淋巴细胞对骨肉瘤细胞系U2-OS的杀伤活性。方法 用HER-2抗原肽段E75369-377（HER-2组）、PBS（PBS组）分别负载PBMC来源的树突状细胞，与T淋巴细胞共培养7d后检测各组T细胞穿孔素的表达，通过LDH释放法比较两组T细胞对U2-OS的杀伤活性。结果 HER-2组的T细胞表达穿孔素高于PBS组（P0.01）；HER-2组的T细胞对U2-OS的杀伤率高于PBS组（P0.01）。结论 用HER-2抗原肽E75369-377负载树突状细胞诱导T细胞能提高对骨肉瘤细胞系U2-OS的杀伤效率。 　　关键词：树突状细胞；HER-2；骨肉瘤；免疫治疗 　　负载肿瘤抗原的树突状细胞可以诱导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤免疫效应[1]，据此我们用人类表皮生长因子受体2（HER-2）负载人树突状细胞诱导同源的T淋巴细胞，观察其对人骨肉瘤细胞系U2-OS的杀伤活性。 　　1资料与方法 　　1.1 一般资料 骨肉瘤细胞株U2-OS购自中国科学院上海细胞库；HER2（E75369-377）肽段购自上海强耀生物科技有限公司；rhGM-CSF、IL-4和TNF-a购于PeproTech公司；重组人白细胞介素-2（rhIL-2）购于北京双鹭药业股份有限公司；Anti-Human HLA-DR APC购于美国BD公司；Anti-Perforin antibodies human PE购于德国Miltenyi公司；Cell Permeabilization Kit购于ADG公司；CytoTox96？非放射性细胞毒性检测试剂盒购于美国Promega公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DC的分离、培养、及鉴定 从健康成人中筛选出5名HLA-A2表型阳性的志愿者，抽取外周血10ml，用Ficoll密度梯度离心法[2]提取外周血单个核细胞（PBMC），细胞计数平均在5×107～7×107个；用贴壁法分离出单核细胞，悬浮的淋巴细胞冻存备用。单核细胞用含800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4的1640培养基培养，添加15%的无支原体胎牛血清（FBS），诱导其向树突状细胞（DC）分化。培养第5d时加TNF-α100ng/ml刺激DC成熟。培养至第7d收集细胞105个，用流式抗体APC-HLA-DR标记，同时设置阴性对照，在流式细胞仪上检测成熟DC表面分子标记。 　　1.2.2用HER-2抗原负载DC 收集成熟DC，取1×106个细胞，离心后用2ml含GM-CSF和IL-4的1640培养基重悬，细胞悬液等分为2份，转移到2支5ml EP管中，分别加HER-2抗原肽E75369-377 （2mg/ml） 20ul（HER-2组）、PBS 20ul（PBS组），摇匀后在37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，期间每30min摇匀一次。然后加PBS3ml离心，用淋巴细胞培养基2ml重悬。 　　1.2.3诱导抗原特异性T细胞 提前1d复苏同源的淋巴细胞，用1640培养基（添加15%的FBS）在37℃、5%CO2培养箱中培养一天，观察细胞状态。取1×107个淋巴细胞，按DC：T为1：10的比例分别与HER-2组和PBS组的DC悬液混合，同时加入细胞因子IL-2（500U/ml）。在37℃、5%CO2培养箱中共培养7d诱导抗原特异性T细胞，每2天补液1ml，并相应添加IL-2。 　　1.2.4检测T细胞穿孔素的表达 收集HER-2组和PBS组经DC诱导的T细胞，每组取106个细胞到流式分析管中，用PBS 3ml洗一遍后加100ul固定液，混匀后室温避光孵育15min；然后加3ml的PBS洗一遍，弃尽上清；然后加入100ul破膜剂，再加流式抗体Anti-Perforin PE 5ul，混匀后避光室温孵育15min；加3ml PBS洗一遍，然后弃尽上清；用100ul PBS重悬细胞，在流式细胞仪上检测T细胞穿孔素的表达。 　　1.2.5乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤率 用CytoTox 96R非放射性细胞毒性检测试剂盒，按照说明书操作。收集HER-2组和PBS组经诱导的T细胞作为效应细胞；取对数期生长的U2-OS细胞，调整密度为1.0×105/ml；将T细胞与骨肉瘤细胞U2-OS按40：1、20：1、10：1的比例分别加入96孔板中，每组设3个复孔，同时设T细胞自然释放孔、U2-OS细胞自然释放孔、U2-OS细胞最大释放孔，在37℃、5%C02培养箱里共孵育6h，酶标仪测定波长490nm的吸光度。按以下公式计算杀伤率，杀伤率（%）=（E-S1-S2）/（M-S1）×100%，其中E=