霍山石斛糖蛋白的分离纯化和毒活性研究.docVIP

霍山石斛糖蛋白的分离纯化和毒活性研究 　　[摘要]霍山石斛是名贵中药材，其多糖的抗肿瘤活性是中药资源领域的研究热点，该研究旨在探究霍山石斛多糖抗肿瘤活性的物质基础。实验以霍山石斛为原料，通过低盐溶液浸提和硫酸铵分级沉淀得到不同的霍山石斛蛋白组分，经SDSPAGE电泳染色确定糖蛋白组分，再经DEAE离子柱和Sephadex凝胶柱进一步分离纯化糖蛋白组分，同时采用MTT比色法检测不同产物对人肝癌细胞HepG2的毒活性；结果获得3种相对分子质量为225，198，156 kDa 的糖蛋白组分RG1，RG2，RG3，测得三者复合物对HepG2的IC50为53423 mg? L-1，而组分RG1，RG2的IC50分别为43296，41391 mg? L-1，组分RG3对HepG2无毒活性。总之，实验结果提示霍山石斛多糖抗肿瘤活性的物质基础之一是相对分子质量为225，198 kDa的2种糖蛋白组分，且具有协同效用。 　　[关键词]抗肿瘤活性； 霍山石斛； 糖蛋白； 细胞毒活性 　　兰科植物霍山石斛Dendrobium huoshanense Tang et Cheng，局限分布于安徽省霍山县及邻近地区，其炮制后的干品名为霍斗或金霍斗[1]，霍山石斛的功效作用一直?槊鳌⑶灞静菹晗讣窃兀?具有益精强阴、保肝养胃、生津止渴、补虚赢、轻身延年等功效[2]，从 20 世纪 50 年代末开始，国内科研人员开始霍山石斛资源保护、可持续开发利用等方面研究，取得了一系列成果，特别是其显著的抗癌功效吸引着国内学者对其开展了大量科学研究[36]。 　　多糖以2种方式发挥抗肿瘤的活性：一种方式是通过增强机体免疫力进而激活免疫系统引起肿瘤细胞凋亡[714]；另一种方式是直接以其细胞毒活性而杀伤肿瘤细胞[1520]。但目前多糖的抗肿瘤活性的研究只限于分离提纯后的多糖组分的药理药效实验，尚无确切的证据证明和解释多糖对肿瘤细胞的细胞毒活性的具体物质基础及结构基础[2123]。 　　霍山石斛多糖具有抗肿瘤活性，那么其基础活性物质到底是什么？本团队在实验过程中发现，采用水提醇沉提取霍山石斛粗多糖，再用Sevage法[24]脱蛋白后得到的脱蛋白多糖对人肝癌细胞HepG2的毒活性明显低于没有经过脱蛋白处理的霍山石斛粗多糖，国内一些学者也发现类似现象[2526] 。同时，国内外有研究显示植物糖蛋白有较强的抗肿瘤、增强免疫力的作用[2731] 。因此，根据对粗制霍山石斛多糖和脱蛋白多糖抗肿瘤比对效果，假设霍山石斛多糖中存在一些能被有机溶剂破坏或除去的糖复合物，如糖蛋白，这类物质是构成霍山石斛多糖抗肿瘤的基础物质之一。为验证假设，利用低盐溶液浸提加硫酸铵分级沉淀分离提取出不同的霍山石斛蛋白组分，再经DEAE Bsarose Fast Flow 离子柱和SephadexG200凝胶柱分离得到糖蛋白，以粗制多糖、脱蛋白多糖和糖蛋白为研究对象，检验霍山石斛糖蛋白是否具备对人肝癌细胞HepG2的毒活性。 　　1材料 　　实验材料为根系生长3年以上，当年春季抽条越冬后的霍山石斛鲜茎（去叶），按统计学方法五点取样[32]，2016年3月采自安徽省霍山县衡山镇柳林河栽培基地（六安臻和生物科技有限公司），由邓辉副教授鉴定。人肝癌细胞HepG2（上海奥陆生物科技有限公司），阿霉素 （意大利Actavis Italy SpA， 批号；DEAE Bsarose Fast Flow利穗科技（苏州）公司产品；Sephadex G200 Sigma 公司产品；NaHCO3、硫酸、苯酚、葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、考马斯亮蓝G250/R250、硝酸银、碱性品红、偏重亚硫酸钠、高碘酸、活性炭、甲醇、冰乙酸等均为国产分析纯。 　　色谱柱（26 cm×55 cm， 16 cm×80 cm），利穗科技（苏州）有限公司；UV2100 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；旋转蒸发仪，天津市纽森科技有限公司；Mini垂直电泳仪，北京六一仪器厂；Allegra15R 台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司； CO150型CO2培养箱，美国Thermo公司；Multiskan Spectrum全波长酶标仪，美国Thermo公司。 　　2方法和结果 　　21霍山石斛多糖的分离提取将同一种石斛切成薄片后混合，60 ℃烘干至恒重，85 ℃无水乙醇索氏提取至回流液无色，挥干溶剂，药渣按照料液比1∶5加入蒸馏水于80 ℃水浴冷凝回流提取4次，每次3 h[12]。合并滤液并减压浓缩获得粗多糖溶液。上述粗多糖溶液，按1∶4加入无水乙醇，4 ℃冰箱静置24 h，4 000 r min-1离心5 min，循环操作3～4次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即为粗制多糖[3