旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定.pdfVIP

旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定 2 高长玲1，刘明远n，郭恒‘，孙树民1，付宝权L2，崔国祯1，卢强1，陈启军3，P．Boireau (1．吉林大学人兽共患病研究所，吉林长春130062：2．法国食品卫生安全局，巴黎94703： 3瑞典微生物与肿瘤研究中心，斯德哥尔摩S-17177) 摘要：根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK-CMV-N10序列设计引物，利用PER技术将基因NIO的信号肽去除后， 用IPTG诱导表达出与理论相符的融合蛋白，相对分子质量为38．7kDa，诱导4h的表达量占菌体总蛋白量的15％。并 将N10重组蛋白提取可溶性融合蛋白，对其生物学特性进行初步鉴定，结果表明具有类似脱氧核糖核酸酶II的活性_ 一／ 旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种人兽共患的寄生性线虫病，由于其病原传播极其复杂，该病尚 未得到完全有效的控制，成为一种全球性的疾病川。旋毛虫生活史大致分为三个时期：成虫期、新 生幼虫期、肌幼虫期。旋毛虫新生幼虫是旋毛虫生活史中唯一非细胞内寄生而在血液中移行，对宿 主的免疫作用是最敏感时期。因此，从旋毛虫新生幼虫期入手，为建立更加可靠的旋毛虫病的诊断 及防治方法提供新的途径。 本室已利用抑制性差减杂交技术构建旋毛虫新生幼虫差减eDNA文库垤1，对其筛选获得旋毛虫 酸杂交筛选，成功地获得了两条同源性较高全长eDNA序列的基因：分别命名为N5(注册号为 糖核酸酶II(DNase 香港大学的Ko RC教授睁在研究中发现旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中具有很强的核酸酶活性，并用实 验进一步证实了核酸酶参与了包囊形成的可能性。本实验将N10基因克隆于原核表达载体后，在大 肠杆菌中进行了高效表达，并将其重组蛋白提取可溶性融合蛋白进行酶的活性初步鉴定，为探求旋 毛虫包囊形成相关基因的研究奠定理论基础。 1材料与方法 1．1旋毛虫虫株 旋毛虫虫株为中国猪旋毛虫分离株，国际标准虫株编号为ISS534。 1．2主要工具酶、试剂 BamHI、XhoI、T4 DNA聚合酶购于TaKaRa公司： DNA连接酶、Taq DL2000、Universal Buffer及其它常用试剂均购TaKaRa公 IPTG均购于Promega公司：DDT、Marker terminator、RV．MPrimer与M13．47 司；Primerl、T7与T7 胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒及DNA快速纯化回收试剂盒均购于杭州维特洁生化试剂公司。 (Ecoil)NovaBlue、BL21star(DE3)均购于Novagen公司。 1．4目的基因的克隆 1．4．1引物设计 由于旋毛虫新生幼虫期特异性N10全长eDNA上游57端带有信号肽，不利于原 核表达，因此利用PCR技术将信号肽去除。根据旋毛虫新生幼虫N10基因序列设计引物：上游引物 Pdmerl，序列为5 I酶切位 其序列为5 I酶切位 点CTCGAG。因此扩增产物可用BamHI与劢0 I进行双酶切，以用于与pET-28裱达载体重组。 1．4．2目的片段的PCR扩增 buffer 总反应体积为509l，其中10xPCR 1．O山，17(50pmol／91)1．0p1，dNTP(各10mM)1．09l，Taq 。 一 72℃延伸10min。