高级生物化学-蛋白质性质和分离4课件.pptVIP

1. 等电点沉淀和PH控制 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。 不同的蛋白质，具有不同的等电点。在生产过程中应根据分离要求，除去目的产物之外的杂蛋白 2、有机溶剂分级分离法 （1）定义：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的 溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂 沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 （2）作用机理： （1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； （2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 （3）优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。 3、盐溶和盐析 常用的盐：为溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、 MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层使蛋 白质溶解度增加； 盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层使蛋 白质溶解度降低，发生沉淀析出。（PH多在PI） 分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶 液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称 分段盐析（例如：半饱和硫酸铵溶液可沉淀可卵清 球蛋白，而饱和硫酸铵溶液沉淀卵清清蛋白） 盐 溶 盐 析 有A,B,C 三种蛋白质,在PH=7进行电泳，结果如下图。若在PH=7用中性盐沉淀这三种蛋白质，哪种首先沉淀，其次是哪一种，最后是哪一种？ 　　　　　　　　　 ????????????????????????? 从电泳结果可知 PH 7 时C蛋白带电最多，B蛋白次之，A最少，在PH 7时用中性盐沉淀，带电最少的首先沉淀。因此 A 先沉淀 ，其次是B，最后是C。 思考题 （三）根据电荷不同的分离方法 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，电泳时可以分开 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 电泳和离子交换层析 支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ① 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸 的定性定量分析。 ② 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血 清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于 保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ③ 淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④ 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤ 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷效应不同和分子筛效应进行分离。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者更佳。 浓缩效应： 样品胶 中间浓缩胶 下层分离胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图 1. 某蛋白质溶液分别用SDS和阳离子交换柱层析进行分析，得到如图所示的结果。关于该溶液中蛋白质的组成，你的结论是什么？ 思 考 题 阳离子交换柱层析进行分析 SDS. 比较说明SDS(SDS-聚丙烯酰胺电泳)和琼脂糖凝胶电泳的物质 浙江大学2004 2、等电聚焦电泳： 在电泳支持介质中加入载体两性电解质通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用