神经医学常用抗原修复方法汇总.docVIP

抗原修复大全 组织在福尔马林或其它固定液中固定会引起位于蛋白内或蛋白间的亚甲基桥的桥连，引起许多抗原决定簇被封闭。如在组织切片前未进行某种形式的抗原修复，免疫染色结果将不能令人满意甚至不能成功。最常用的抗原修复技术是酶消化和热引导的抗原决定簇的修复(heatinduced epitope retrieval,HIER)，但其它技术，如声波处理抗原修复技术也在某些实验室应用。有些抗体则适宜于几种抗原修复技术的联合使用，如酶消化加HIER可使anti-calponin抗体的染色效果最佳。有关抗原修复的基本要素如下： 　　1　足够的抗原修复是影响免疫组化染色结果最重要的因素，总的说来，较检测系统更为重要。 　　2　尽管某种形式的抗原修复对大多数抗体有益，但有些抗体经抗原修复后不再发生反应(例如某些不需要抗原修复的抗体)。 　　3　主要的抗原修复形式包括： 　　。酶处理，如：胰蛋白酶、胃蛋白酶、pronase 　　。热引导的抗原决定簇修复，使用湿热。HIER对大多数的抗体有益，特别是核抗原(对它们来说，HIER可能是抗体工作的前提条件，如Ki-67、雌激素)。 　　4　某些抗体适宜于几种抗原修复方法联合使用，如anticalponin抗体经酶处理及HIER联合修复后抗体工作效果最佳。 　　5　抗某一抗原的不同抗体可能需要不同的抗原修复方式，如有些抗CD21的抗体可能需要酶消化，而另一些则需要HIER。 　　6　使用HIER时，要注意两个基本点： 　　。抗体孵育前每一步操作均勿使组织干燥，否则免疫反应可能完全不能进行。 　　。加热后放置足够的时间(至少10～20 min)使之变凉是必需的，可假设为允许蛋白恢复到它的自然结构，否则HIER将无任何效果。 　　目前常见的抗原修复液，如：枸橼酸缓冲液、尿素、EDTA、Tris-HCl、氯化铵和商品化靶修复液。作者选择压力锅HIER方法，结果表明在pH8.0 1 mmol/L EDTA溶液中修复的效果最佳，特别是与常用的枸橼酸缓冲液(pH6.0)比较。 　　有人认为EDTA-HIER的作用机制是通过钙离子的鳌合而实现的，而且这种鳌合作用只有在碱性pH值下才起作用(注意：枸橼酸缓冲液作用似乎也是通过钙离子的鳌合而实现的，并且也是在高pH值下工作的效果最好)。形成于hydromethylene、羧基及磷酸基团间的钙离子配体复合物通过空间排列的障碍作用，封闭了抗原决定簇的位点。因此去除了钙离子即打碎了混合物。然而，对于酸性的抗原修复液，如Tris-HCl，抗原修复似乎是通过高浓度的氢离子离解了钙离子复合物或打断了福尔马林固定产生的交联而实现的。 　　如果一个实验室想将枸橼酸缓冲液换为EDTA溶液作为抗原修复因子，大多数抗体的稀释度将被提高，这就是说，每个抗体的稀释度将要重新估测。这样不仅可以节省抗体，而且可使免疫染色更加稳定。pH值(碱性范围)非常重要，因为对有效的抗原修复来说，pH值似乎比抗原修复液的化学成分更为重要。对大多数抗体，抗原修复液全范围pH值均使HIER进行有效的修复，而对某些抗体，(如：Ki-67、ER)，中间范围的pH值(3.0～6.0)会降低染色的强度，高于或低于此临界带均使染色强度增强。 　　极少数抗体(CD34、HMB45)，用HIER时，在低pH值(1.0～2.0)下染色效果不好，在高pH值下的染色效果极佳。因此，尽管pH值6.0的枸橼酸缓冲液可使大多数抗体良好地工作，但不可能总是工作良好。作为通用的修复液，碱性pH值的修复液远较枸橼酸缓冲液有效，而固定了很长时间或是非常旧的档案资料，酸性pH值的抗原修复液的工作效果优于碱性pH值的修复液(包括EDTA)，因此在通用抗原修复液不能进行免疫染色或染色效果不佳时，酸性抗原修复液可作为替代物。 　　(湖北省十堰东风汽车公司中心医院病理科李金范摘译自John KC Chan刊登在Advances in Anatomic Pathol上的文章) 抗原修复方法 Proteolytic antigen retrieval using Trypsin Reagents:Calcium Chloride 0.1gTrypsin (Sigma Type II) 0.1gDistilled Water 100 mlSodium Hydroxide (0.1 M)Method:1.Dissolve calcium chloride in distilled water and pH to 7.8 with sodium hydroxide. Store at 37oC.2. Dissolve trypsin in calcium chloride solution.3. Place sections in